星点设计-效应面法优化野扇花颗粒制备工艺及其药效学研究△

邱宏聪，韦桂宁，何开家，陈明生，梁冰

广西中医药研究院/广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁 530022

野扇花为黄杨科植物Sarcococca ruscifoliaStapf.的干燥全株，是广西、贵州等地少数民族常用的民间草药，收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》，味辛、苦，性平，具有行气活血、祛风止痛之功效，用于胃脘疼痛、风寒湿痹、跌打损伤[1]。野扇花富含甾体类生物碱等化学成分，其药理活性作用主要为缓解胃肠道症状[2]。近年来，本课题组将野扇花作为治疗胃痛、胃溃疡的单方药物，泡酒使用，先后在广西都安县人民医院及广西中医药大学附属瑞康医院使用，具有疗效确切、治愈率高的特点。本研究制备野扇花颗粒采用星点设计（CCD）-效应面法优化制备工艺，完成制剂抗胃溃疡、镇痛等药效学实验研究，为野扇花的临床应用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

XS205 型分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；GJ-8402型热板测痛仪（浙江宁海白石电子医疗仪器厂）；XYH-2A型体视显微镜（上海光学仪器厂）。

1.2 试药

对照品矮陀陀胺碱A（上海源叶生物科技公司，批号：30007-2013，纯度>98%）；乙醇、甲醇、盐酸、氢氧化钠等其他试剂均为分析纯；盐酸雷尼替丁胶囊（广东逸舒制药有限公司，批号：201407040.15 g/粒）；罗通定片（山东明仁福瑞达制药股份有限公司，批号：130301，30 mg/片）；野扇花颗粒（广西中医药研究院自制）。

昆明种小鼠，体质量为18～22 g，雌雄兼用，清洁级，由广西医科大学实验动物中心提供。实验动物许可证号：SCXK 桂2014-0002，饲养于广西中医药研究院SPF级动物房。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 野扇花总生物碱含量测定 取本品细粉约1 g，精密称定，加入盐酸50 mL，超声30 min，滤过，精密量取上清液10 mL，用浓氨试液调pH 至10，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，残渣加乙醇5 mL使溶解并转移至锥形瓶中，精密加入盐酸滴定液（0.01 mol·L-1）10 mL，摇匀，加甲基红指示剂3～4 滴，用氢氧化钠滴定液（0.01 mol·L-1）滴定，即得。每毫升盐酸滴定液（0.01 mol·L-1）相当于1.80 mg 矮陀陀胺碱A（C24H41NO）。

2.1.2 标准曲线的建立 分别按照取样量的40%、60%、80%、100%、120%、140%、160%称取不同质量的本品细粉，按2.1.1 项下方法，记录测定结果，以供试品质量为横坐标（X）、盐酸滴定液体积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，并得到线性回归方程：Y=1.673X-0.120（r=0.999 5），线性 关系良好。

2.1.3 重复性试验 取同一批样品（批号：140301），按2.1 项下方法平行测定6 份，6 份野扇花总生物碱平均质量分数为2.78 mg·g-1，RSD 为1.87%，结果表明该方法重复性良好。

2.1.4 加样回收率试验 取2.1.3 项下的样品约0.5 g，平行6 份样品，分别精密加入矮陀陀酰胺碱A 对照品溶液（0.724 mg·mL-1）2 mL，按2.1 项下方法提取、测定，计算回收率，结果平均回收率为96.45%，RSD 为2.43%，结果表明本方法回收率良好。

2.2 提取溶剂的选择

对提取溶剂的选择采用单因素考察，采用30%、50%、70%乙醇分别对野扇花进行回流提取，结果总生物碱质量分数分别为2.65、3.09、3.13 mg·g-1，50%、70%乙醇提取结果相近，从节约成本因素考虑，采用50%乙醇作为提取溶剂。

2.3 CCD效应面法优化野扇花颗粒制备工艺

2.3.1 野扇花颗粒制备方法 取野扇花，用50%乙醇回流提取，滤液合并，浓缩至相对密度为1.30～1.35（60 ℃）的稠膏，加入适量蔗糖，混匀，制成颗粒，干燥，装袋，即得。

2.3.2 效应面设计及结果 根据CCD 效应面试验设计原理，以影响野扇花总生物碱提取率的主要因素料液比（A）、提取次数（B）、提取时间（C）为自变量，采用3因素3水平效应面方法，因素水平见表1。以总生物碱含量作为指标，效应面试验设计及结果见表2。

表1 CCD效应面优化野山花颗粒制备工艺试验因素水平

表2 野山花颗粒CCD效应面试验设计及结果

2.3.3 数据处理与方差分析 采用Design Expert 8.0 软件对数据进行多元回归分析，得到回归方程：Y=2.91+0.14A+0.61B+0.088C-0.063AB-0.0025AC+0.10BC-0.10A2-0.61B2+0.055C2。根据回归方程进行方差分析（表3），影响总生物碱含量各变量的主次顺序为B>A>C，其中提取次数差异有统计学意义（P<0.01），料液比差异有统计学意义（P<0.05），提取时间差异无统计学意义，模型回归方程具有显著意义（P<0.05），失拟项结果不显著，说明所选用的回归方程良好。

表3 野山花颗粒CCD效应面模型方差分析结果

2.3.4 效应面分析及优化 采用Design Expert 8.0软件，根据回归方程分析结果，以1个因素固定于0水平，剩余2 个因素相互作用，分别绘制三维效应面图，见图1～3，可直观分析各因素对总生物碱含量的影响及因素间的相互作用。Design Expert 8.0软件计算出13 种优化方案，其中最优预测方案：料液比为1∶12.51，提取次数为2.55 次，提取时间为120 min，总生物碱质量分数为3.29 mg·g-1。结合效应优化分析结果，综合考虑生产周期及成本，确定优化提取条件料液比为1∶12，提取2次，每次120 min。

图1 料液比和提取次数对总生物碱含量的三维效应面图

图2 料液比和提取时间对总生物碱含量的三维效应面图

图3 提取次数和提取时间对总生物碱含量的三维效应面图

2.3.5 最优制备工艺验证 按照2.3.1 项下方法及优化的工艺，以50%乙醇作为提取溶剂，料液比为1∶12，提取2次，每次120 min。制备3批野扇花颗粒，总生物碱平均质量分数为3.10 mg·g-1。以偏差作为所建模型预测性是否良好的指标，按公式（1）计算，结果偏差值为5.78%，表明所建立的模型具有良好的预测性。

2.4 野扇花颗粒药效学实验

2.4.1 对小鼠应激性胃溃疡的影响 选取健康昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，即对照组，模型组，雷尼替丁组（0.1 g·kg-1），野扇花颗粒高、中、低剂量组（6.0、3.0、1.5 g·kg-1），每组10只。每天灌胃给药1 次，连续10 d，对照组、模型组给予等体积蒸馏水。小鼠禁食24 h 后进行末次给药，给药后1 h，除对照组外，将各组小鼠四肢固定于模板上，浸泡于22～25 ℃水中14 h。取出小鼠，处死，解剖，分别结扎胃幽门和贲门，每只小鼠胃内注入10%甲醛溶液1 mL，固定10 min 后，体视显微镜下观察胃部的溃疡点数。和对照组比较，模型组小鼠溃疡点数显著增多，模型制模成功；和模型组比较，野扇花颗粒高剂量组可显著降低应激性胃溃疡小鼠溃疡点数。结果表明，野扇花颗粒具有抗胃溃疡作用，结果见表4。

表4 野扇花颗粒对小鼠应激性胃溃疡的影响（,n=10）

表4 野扇花颗粒对小鼠应激性胃溃疡的影响（,n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4.2 对小鼠热板痛阈的影响 选取健康昆明种小鼠，将预先经筛选的雌性小鼠（除去反应过敏<5 s及迟钝>30 s 的小鼠）随机分5 组，即对照组（等体积蒸馏水），阳性药罗通定组（0.06 g·kg-1），野扇花颗粒高、中、低剂量组（6.0、3.0、1.5 g·kg-1）。先测出各组小鼠给药前的痛阈值后，分别灌胃给药，对照组给予蒸馏水，阳性组给予罗通定，野扇花组给予野扇花颗粒药液，给药7 d，末次给药后60、90、120 min测定各小鼠痛阈值。和对照组比较，给药后60 min，野扇花颗粒高剂量组可显著延长小鼠热刺激性疼痛的潜伏期。结果表明，野扇花颗粒具有镇痛作用，结果见表5。

表5 野扇花颗粒对小鼠热板痛阈的影响（,n=10）

表5 野扇花颗粒对小鼠热板痛阈的影响（,n=10）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；表6同。

2.4.3 对醋酸引起小鼠扭体反应的影响 选取健康昆明种小鼠50 只，雌雄各半，分组、给药方式同2.4.2项下方法，连续灌胃给药7 d，末次给药后1 h，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL，5 min 后记录15 min 内各鼠出现的扭体反应次数。和对照组比较，野扇花颗粒高剂量组可显著降低醋酸引起小鼠扭体次数。结果表明，野扇花颗粒具有镇痛作用，结果见表6。

表6 野扇花颗粒对醋酸引起小鼠扭体反应的影响（,n=10）

表6 野扇花颗粒对醋酸引起小鼠扭体反应的影响（,n=10）

3 讨论

常用正交设计方法精度不够，建立的数学模型预测性较差，因此，集数学和统计学方法于一体的CCD 效应面法被广泛应用[3-7]，通过水平因素与考察指标之间线性或非线性关系描绘效应面，进行方差分析，从拟合的效应面上优选效应区域，提高了拟合的精度，从而使最优条件下效应面的预测值和实测值相近。效应面法也存在水平因素过多时，实验次数过多的不利之处，本研究先采用单因素考察对提取溶剂进行选择，优选了50%乙醇作为提取溶剂，然后按照效应面设计表进行实验，减少了实验次数，同时控制了实验的误差。

野扇花是苗族、壮族等少数民族地区常用于治疗胃病、跌打损伤、头晕心悸、喉咙肿痛的中药，富含清香桂碱、富贵草碱、表富贵草碱、海南野山花碱等甾体类生物碱[8-12]。研究表明，野扇花总生物碱有较好的抗溃疡、解痉、镇静、耐缺氧等药理活性[13]，对胃肠道平滑肌有明显的兴奋作用[14]。野扇花颗粒剂的初步药效学研究表明，其具有较好的抗溃疡、镇痛作用，为下一步将其开发成民族药制剂提供了参考。