腰肾膏指纹图谱研究

杜蔼媚，郭韵妍，招嘉文，李慧华

国药集团德众（佛山）药业有限公司，广东 佛山 528000

腰肾膏为肉苁蓉、八角茴香、熟地黄、补骨脂、淫羊藿、蛇床子等2 种中药，加上樟脑、冰片、薄荷素油、肉桂油、水杨酸甲酯、盐酸苯海拉明、白凡士林、橡胶等原辅料，使用现代中药制剂技术制成的橡胶膏剂，具有温肾助阳、强筋壮骨、祛风止痛的作用，用于肾虚型腰膝酸痛、肌肉酸痛、夜尿的治疗。

腰肾膏现执行标准为国家药品标准WS3-B-3514-98-2003，标准对处方中复杂多样的药材质量控制未作全面检测与分析。为了全面控制腰肾膏的质量，本研究参照中药注射剂指纹图谱的要求[1]，及参考相关文献[2-6]，以腰肾膏为对象，经实验对比后得出采用水蒸气蒸馏、乙酸乙酯收集挥发性成分，50%甲醇提取膏体中成分最为合适，后分别用气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）对上述提取物进行指纹图谱研究，建立了2 个腰肾膏指纹图谱，为腰肾膏整体质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1100 型高效液相色谱仪、7890B 型气相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Dionex U3000型高效液相色谱仪、Chromeleon 色谱工作站、Openlab 2.0色谱工作站（美国赛默飞世尔科技有限公司）；BRANSON 5510 型超声清洗机［必能信超声（上海）有限公司］；KQ-400DE型超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；明澈-D24型纯水机（Millipore公司）；SQP型电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试药

腰肾膏［国药集团德众（佛山）药业有限公司，批号分别为18002、18008、18011、18022、18024、18026、18031、18032、18036、18038、18042、18046、18047、18052、18049、19001、19003、19004、19008、19009、19010］；樟脑（梧州黄埔化工药业有限公司，批号：Yz1715041）；薄荷素油（黄山天目薄荷药业有限公司，批号：180208）；肉桂油（福建中益制药有限公司，批号：171001）；水杨酸甲酯（佛山市南海中南药化厂，批号：170907）；冰片（株洲松本药业有限公司，批号：171203）。

药材和饮片经国药集团德众（佛山）有限公司中药材鉴定师梁健徽鉴定均为正品，且符合《中华人民共和国药典》2020年版标准，见表1。

表1 实验所使用饮片信息

甲醇、乙腈（Fisher Scientific，色谱纯）；三氟乙酸（Shanghai Macklin Biochemical Co.，Ltd.，分析纯）；甲醇、无水乙醇、乙醇（广东光华科技股份有限公司，分析纯）；乙酸乙酯（广东光华科技股份有限公司、江苏强盛功能化学股份有限公司，分析纯）；无水硫酸钠（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；萘（天津福晨化学试剂厂，分析纯）；环己烷（天津永大化学试剂有限公司，分析纯）。

对照品薄荷脑（批号：110728-201707，纯度：99.8%）、桉油精（批号：110788-201707，纯度：100%）、丁香酚（批号：110725-201716，纯度：99.6%）、反式茴香脑（批号：111835-201503，纯度：99.7%）、龙脑（批号：110881-201709，纯度：99.6%）、桂皮醛（批号：110710-201821，纯度：99.6%）、蛇床子素（批号：110822-201710，纯度：99.5%）、补骨脂素（批号：110739-201617，纯度：99.7%）、（-）-薄荷酮（批号：117705-201105，纯度：99.8%）、异补骨脂素（批号：110738-200511，纯度：100.0%）均购于中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 气相色谱条件 ZB-WAX 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为氮气；流速为1 mL·min-1；进样口温度为200 ℃；分流比为10∶1；检测器温度为280 ℃；进样量为1 μL；柱温起始温度为90 ℃，保持7 min，以10 ℃·min-1升至115 ℃，保持10 min，再以3 ℃·min-1升至150 ℃，再以0.5 ℃·min-1升至160 ℃，最后以10 ℃·min-1升至240 ℃，并保持30 min。

2.1.2 高效液相色谱条件 Welch Ultimate XB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈为流动相A，0.02%三氟乙酸为流动相B，进行梯度洗脱（0～55 min，85%B；55～65 min，85%～53%B；65～80 min，53%～50%B；80～87 min，50%～35%B；87～97 min，35%～27%B）；检测波长：245 nm；进样量：20 μL。

2.2 供试品溶液的制备

气相色谱供试品溶液：取腰肾膏3 片，剪成条状，除去盖衬，疏松黏结成团，加水100 mL 与玻璃珠数粒，置烧瓶中，连接挥发油测定器，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止，加入乙酸乙酯2 mL，连接回流冷凝器，置电热套中加热回流3 h。放冷，将挥发油提取器的乙酸乙酯层放入分液漏斗中，再分别用乙酸乙酯2、2、1 mL 冲洗挥发油提取器，洗液并入分液漏斗中，静置，弃去水层，乙酸乙酯层通过载有无水硫酸钠1 g的滤纸，滤入10 mL 量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，摇匀，即得。

高效液相色谱供试品溶液：取出提取后的膏体于105 ℃烘干，剪碎，置具塞锥形瓶中，加50%甲醇90 mL，超声60 min，放冷，为供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

气相色谱指纹图谱用对照品溶液：取（-）-薄荷酮适量加无水乙醇溶解制成5 mg·mL-1的对照品溶液；取桉油精适量，加无水乙醇溶解成0.15 mg·mL-1的对照品溶液；取丁香酚适量加环己烷溶解成2 mg·mL-1的对照品溶液；取薄荷脑30 mg至10 mL量瓶中，加萘内标液（取萘适量加无水乙醇制成1.8 mg·mL-1的溶液）溶解至刻度作为对照品溶液；取反式茴香脑适量加乙醇溶解成0.5 mg·mL-1的对照品溶液；取龙脑适量加乙酸乙酯溶解成4 mg·mL-1的对照品溶液。

高效液相色谱指纹图谱用对照品溶液：取五味子醇甲适量加甲醇溶解成0.4 mg·mL-1的对照品溶液；取蛇床子素适量加甲醇溶解成0.03 mg·mL-1的对照品溶液；取补骨脂素及异补骨脂素适量加甲醇溶解成0.02 mg·mL-1的对照品溶液；取甘草酸铵适量加甲醇溶解成0.02 mg·mL-1的对照品溶液。

2.4 供试品溶液与阴性供试品溶液的制备

按腰肾膏处方比例取处方各味中药适量，分别按2.2 项下方法制备气相色谱指纹图谱和高效液相色谱指纹图谱研究用的供试品溶液。

高效液相色谱用阴性供试品溶液：按腰肾膏处方比例和工艺分别制备各味中药的阴性样品，按2.2项下方法制备高效液相色谱用阴性供试品溶液。

3 方法学考察

3.1 高效液相色谱方法学考察

3.1.1 精密度试验 取腰肾膏（批号：18046），按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.2 项下条件连续进样测试6 次，以蛇床子素的保留时间和峰面积作为参照，记录色谱图，导入“中药指纹图谱色谱相似度评价系统”2012 版，计算相似度，结果测得相似度均为1，说明仪器精密度良好。

3.1.2 重复性试验 取腰肾膏（批号：18046）6份，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.2项下条件进样测试，记录色谱图，导入“中药指纹图谱色谱相似度评价系统”2012 版，计算相似度，结果测得相似度均为0.999，说明该方法重复性良好。

3.1.3 稳定性试验 取腰肾膏（批号：18046）高效液相色谱供试品溶液，分别于0、12、29、41 h，按2.1.2 项下条件进样测试，记录色谱图，导入“中药指纹图谱色谱相似度评价系统”2012 版，计算相似度，结果测得腰肾膏高效液相色谱供试品溶液在41 h 内，各时间点进样得到的色谱图相似度分别为0.995、0.995、0.998、0.999，表明高效液相色谱供试品溶液中各成分在41 h内稳定性良好。

3.2 气相色谱方法学验证

3.2.1 精密度试验 取腰肾膏（批号：18046），按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下条件连续进样测试6 次。以水杨酸甲酯的保留时间和峰面积作为参照，记录色谱图，导入“中药指纹图谱色谱相似度评价系统”2012 版，计算相似度，结果相似度均为1，说明仪器精密度良好。

3.2.2 重复性试验 取腰肾膏（批号：18046）6份，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下条件进样测试，记录色谱图，导入“中药指纹图谱色谱相似度评价系统”2012 版，计算相似度，结果相似度分别为1.000、1.000、0.999、1.000、1.000、1.000，说明该方法重复性良好。

3.2.3 稳定性试验 取腰肾膏（批号：18046）气相色谱供试品溶液，分别于0、9、17、29 h，按2.1.1 项下条件进样测试，记录色谱图，导入“中药指纹图谱色谱相似度评价系统”2012 版，计算相似度，结果测得腰肾膏高效液相色谱供试品溶液在29 h 内，各时间点进样得到的色谱图相似度分别为0.995、0.995、0.998、0.999，表明气相色谱供试品溶液中各成分在29 h内稳定性良好。

4 腰肾膏指纹图谱的建立与相似度评价

取20批腰肾膏，分别按2.2项下方法制备供试品溶液。

4.1 高效液相色谱指纹图谱

按2.1.2项下条件进样测定，记录色谱图。导入“中药指纹图谱色谱相似度评价系统”2012版，计算相似度，各批腰肾膏色谱图相似度为0.912～0.990（表2），生成腰肾膏高效液相色谱指纹对照图谱（图1）。得到52个共有峰。

图1 腰肾膏高效液相色谱指纹图谱及对照图谱

表2 20批腰肾膏高效液相色谱指纹图谱相似度

取高效液相色谱供试品溶液、阴性供试品、对照品溶液按2.1.2 项下条件进行测定，记录各色谱峰保留时间，从而指认指纹谱图中共有峰，其中得到归属的特征峰见表3。

表3 高效液相色谱指纹图谱特征峰归属对应药材来源

4.2 气相色谱指纹图谱

按2.1.1 项下条件进样测定，记录色谱图导入“中药指纹图谱色谱相似度评价系统”2012版，计算相似度（0～4 min溶剂峰不参与相似度评价），各批次相似度为0.997～1.000（表4），生成腰肾膏气相色谱指纹对照图谱（图2）。取气相色谱供试品溶液、对照品溶液按2.1.1 项下条件进行测定，记录各色谱峰保留时间，从而指认指纹谱图中共有峰，其中得到归属的特征峰见表5。

图2 腰肾膏气相色谱指纹图谱及对照图谱

表4 20批腰肾膏气相色谱指纹图谱相似度

5 讨论

5.1 样品前处理

腰肾膏作为橡胶膏剂，膏体基质较复杂，单纯用顶空或者超声提取并不能全面地评价其成分组成。通过挥发油提取器使其挥发油成分与膏体分离，剩余膏体用50%甲醇提取，把复杂的成分分为2个部分，减少了后续分离的难度。

使用挥发油提取器分离挥发性成分时考察了2、3、4、5 h 4 个提取时间，经对比后发现，提取2 h后的膏体内仍有挥发油的干扰；而在3 h后的高效液相色谱图趋向一致，但从气相色谱看出，提取时间过长会使部分峰面积变小，有效成分有所损失，故选择3 h作为挥发油提取时间。挥发油提取试验曾分别使用乙酸乙酯和环己烷作为萃取溶剂，得到的色谱图一致。

本品工艺制法为中药用乙醇提取浓缩为稠膏，稠膏与辅料基质混合涂布于弹性布上，剪切成7 cm×10 cm 即得。因此，膏体经过蒸煮3 h 后的水浸液中可溶性成分较少，需要选择合适的溶剂进行下一步提取。提取完挥发油的膏体最初选择50%乙醇、乙醇、甲醇为提取溶剂，发现高效液相色谱指纹图谱中辅料峰较多，带来一定程度的干扰，随后将提取溶剂改为50%甲醇，提取得到的辅料峰较少，故选择50%甲醇进行提取，辅料峰在积分过程中需剔除，不参与指纹图谱评价。气相色谱供试品溶液检测结果显示，基质萜烯树脂在气相色谱指纹图谱中有明显的色谱峰，因此，积分过程需剔除，不参与指纹图谱评价。

5.2 色谱条件的优化

高效液相色谱指纹图谱研究过程中，通过对同品牌、同型号DE 3 根色谱柱Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、不同品牌的4 根色谱柱Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo Aypersil Gol C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax SB-Phengl（250 mm×4.6 mm，5 μm），不同长度2 根色谱柱Welch Ultimate XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）和Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行比较，发现苯基柱分离度差，同品牌C18色谱柱重现性良好，不同品牌C18色谱峰局部出峰顺序或大小不一，故宜选择Welch Ultimate、长度为250 mm 的色谱柱，保证峰形和出峰时间与腰肾膏高效液相色谱对照指纹图谱接近。通过对供试品溶液在210～400 nm 波长进行扫描，发现在波长245 nm 色谱峰较多，峰大小较均衡。故选择245 nm为检测波长。

流动相使用磷酸、醋酸、甲酸、三氟乙酸作为水相流动相，经对比发现三氟乙酸与乙腈配合得到的分离度较好。

在不同高效液相色谱仪（Agilent 1100 型高效液相色谱仪、Thermo U3000 型高效液相色谱仪）上运行该色谱条件，同一样品得到色谱图与标准指纹图谱的相似度分别为0.972、0.970，两者RSD<0.2%，重复性良好。

气相色谱指纹图谱研究过程中，使用了HP-5、ZB-WAX、HP-FFAP、DB-1 毛细管色谱柱进行成分的分离，经比较后发现，ZB-WAX 色谱柱分离度较好，HP-FFAP色谱柱分离度虽合适但出峰时间慢。

5.3 指纹图谱相似度比较

将20批供试品色谱图导入“中药指纹图谱色谱相似度评价系统”2012版计算色谱图相似度，气相色谱指纹图谱以水杨酸甲酯作为参照峰，得到了51个共有峰，对其中20 个共有峰进行了药材归属，相似度为0.990～1.000；高效液相色谱指纹图谱以蛇床子素作为参照峰，得到了52个共有峰，对其中20个共有峰进行了药材归属，相似度为0.912～0.990。

腰肾膏处方药材多达20 种，方中加入樟脑、水杨酸甲酯、薄荷素油等具有挥发性和促进透皮吸收的化学成分。本测定方法稳定、简便，可为腰肾膏制剂及同类剂型的整体化学成分研究提供参考。