双标线性校正法应用于西洋参破壁饮片的指纹图谱研究△

于现花，刘军玲，张亚中，金传山

1.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 230051

西洋参为五加科植物西洋参Panax quinquefoliumL.的干燥根，原产地主要是美国与加拿大，我国从17 世纪开始引进种植。其现已成为我国传统滋补药材。西洋参味甘、微苦，性凉，归心、肺、肾经，具有补气养阴、清热生津作用，用于气虚阴亏、虚热烦倦、咳喘痰血、内热消渴、口燥咽干[1]。现代研究发现，西洋参中含有多种有效成分，具有抗肿瘤、抗癌、降血压、调血脂、抗疲劳等多种药理活性[2-4]。

西洋参破壁饮片是将传统饮片细胞壁打破，通过现代超微粉碎技术粉碎加工成D90（样品累积分布百分数达到90%时所对应的粒径）<45 μm 的粉体，再用无添加赋形技术制成30～100 目的颗粒新型中药饮片。破壁饮片可使中药的有效成分得到更充分释放，进而大幅提高药效。与传统饮片相比，西洋参破壁饮片具有全成分保留，成分利用率高，质量均一，服用方式简单、快捷、灵活等特点[5-9]。近年来，破壁粉碎技术在中药领域中的应用日益广泛，中药破壁饮片品种逐渐增多，对破壁饮片的评价、产业化及应用等方面的研究已成为中药传统饮片传承与改良创新的热门方向，并取得了一定成果。

由于外观性状及显微特征已被破坏，传统饮片的质量评价标准已不适用于破壁饮片质量控制要求[10]。另因西洋参特有成分拟人参皂苷F11为弱紫外吸收成分，因此，需要建立高效液相色谱-电雾式检测器（HPLC-CAD），用于西洋参传统饮片与破壁饮片的指纹图谱分析。目前，指纹图谱研究较为单一，一般仅在1 根色谱柱上开展分析，后续难以适用到其他色谱柱或用相对保留时间法进行色谱峰的定性，其预测保留时间绝对偏差较大，实用性不佳。本实验采用双标线性校正法[11-14]预测特征峰的保留时间，据此建立的西洋参破壁饮片指纹图谱可以适用于不同色谱柱，既扩展了方法的适用范围，又降低了对照品的使用成本，为西洋参破壁饮片质量控制提供参考。

1 材料

Ultimate 3000 型高效液相色谱仪（美国Dionex公司）；XP26 型百万分之一电子分析天平（Mettler公司）；A11 型分析研磨机（IKA 公司）；KQ-100 型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；Simplicity-185型超纯水仪（Millipore公司）。

16根色谱柱，编号col 1～col 16，规格均为250 mm×4.6 mm，5 μm。col 1：Agilent TC-C18（2）；col 2：Diamonsil C18；col 3：GL Wondasil C18；col 4：Innoval C18；col 5：Inspire C18；col 6：JADE-PAK ODS-AQ；col 7：Kromasil 100 5-C18；col 8：Luna C18（2）100A；col 9：Shim-pack VP-ODS；col 10：Sonoma C18（2）100A；col 11：Tech Mate C18ST；col 12：Waters Symmetry C18；col 13：ZORBAX Eclipse XDB C18；col 14：ZORBAX SB C18；col 15：Waters XBridge C18；col 16：Kinetex C18100A。

对照品拟人参皂苷F11（批号：110841-200505，纯度≥98%）、人参皂苷Rg1（批号：110703-201128，纯度≥93.4%）、人参皂苷Re（批号：110754-201626，纯度≥92.7%）、人参皂苷Rb1（批号：110704-201122，纯度≥92.9%）、人参皂苷Rc（批号：110021-14-0，纯度≥98%）、人参皂苷Rb2（批号：111715-200501，纯度≥98%）、人参皂苷Rb3（批号：111686-200501，纯度≥98%）、人参皂苷Rd（批号：111818-201001，纯度≥94.4%）均由中国食品药品检定研究院提供；DRS Origin 软件由中国食品药品检验研究院设计研发，科迈恩（北京）科技有限公司开发；乙腈和甲醇为色谱纯；正丁醇为分析纯；水为超纯水。

10 批西洋参（编号XYS-01～XYS-10）均购于安徽宏信药业发展有限公司，经安徽省食品药品检验研究院张亚中主任中药师鉴定为五加科植物西洋参Panax quinquefoliumL.的干燥根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈（A）-水（B），线性梯度洗脱（0～5 min，81% B；5～25 min，81%～78%B；25～30 min，78%～74%B；30～55 min，74%～50%B；55～60 min，50%～81%B）；柱温：30 ℃；流速：1 mL·min-1；CAD 雾化器温度：35 ℃；进样量：10 μL。上述条件下，各成分分离较好。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取各人参皂苷对照品适量，置于5 mL 量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成含人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 及拟人参皂苷F11分别为0.042 8、0.130 1、0.035 3、0.056 4、0.025 0、0.029 7、0.061 2、0.097 7 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取供试品1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，超声（250 W，50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取2.2 项下的混合对照品溶液，连续进样6 次，每次进样10µL。人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 及拟人参皂苷F11峰面积的RSD 分别为1.70%、0.30%、0.78%、0.84%、0.49%、0.91%、0.68%、1.55%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一供试品（XYS-02）粉末，分别按2.3 项下方法平行制备6 份供试品溶液，测定并计算其含量。样品中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 及拟人参皂苷F11各含量的RSD分别为0.98%、1.12%、1.08%、1.35%、0.79%、1.02%、1.31%、0.45%，表明本法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取新制备的供试品溶液（XYS-02），室温下放置，分别在0、2、4、6、8、12、24 h 进样测定，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd及拟人参皂苷F11峰面积的RSD分别为1.27%、0.96%、1.68%、1.44%、1.64%、0.85%、1.26%、0.43%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5 西洋参破壁饮片与传统饮片相似度评价分析

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012 版软件，中位数法（时间窗为0.1）分别建立西洋参破壁饮片及传统饮片指纹图谱共有模式。结果显示，西洋参破壁饮片及传统饮片指纹图谱均标定17 个共有峰，并指认出1 号峰为人参皂苷Rg1、2 号峰为人参皂苷Re、3 号峰为拟人参皂苷F11、4 号峰为人参皂苷Rb1、5 号峰为人参皂苷Rc、6 号峰为人参皂苷Rb2、7 号峰为人参皂苷Rb3、8号峰为人参皂苷Rd，结果见图1。计算10 批破壁饮片与传统饮片之间的相似度。结果显示，各批破壁饮片与传统饮片之间的相似度均大于0.939（表1）。可见，不同批次间破壁饮片产品均一性和稳定性较好。由图2 可知，各批次破壁饮片与传统饮片之间的关联性较好，也说明西洋参传统饮片制成破壁饮片后，各主要成分均较定，体现了破壁饮片与原传统饮片的物质基础一致，保留饮片全成分的特性。

图1 对照品、西洋参传统饮片供试品和破壁饮片供试品色谱图

图2 西洋参破壁饮片与传统饮片的指纹图谱

表1 10批西洋参破壁饮片与传统饮片之间的相似度

2.6 双标线性校正法定性研究

2.6.1 标准保留时间（SRT）的计算 液相色谱中，化学成分在不同色谱仪和不同色谱柱上的保留时间具有线性关系[15]。通过对照品的保留时间进行色谱峰定位，得到样品实际保留时间，以15 根色谱柱得到的对照品保留时间平均值作为SRT[16]。分别以8 个成分的SRT 为横坐标，依次为人参皂苷Rg132.271 min、人参皂苷Re 32.791 min、拟人参皂苷F1142.371 min、人参皂苷Rb143.933 min、人参皂苷Rc 44.881 min、人参皂苷Rb245.833 min、人参皂苷Rb346.142 min、人参皂苷Rd 47.977 min。以实际保留时间为纵坐标，得到各色谱柱的保留时间拟合结果，见图3，各色谱柱的线性回归方程和相关系数见表2。

图3 不同色谱柱保留时间关系

由图3 和表2 可见，col 15 色谱柱的保留时间拟合直线相对有偏离，说明成分在col 15色谱柱相较于其他色谱柱保留时间相差较大。余下col 1～col 14 色谱柱相关系数均在0.999 以上，说明这14 根色谱柱的保留时间的线性关系良好，可用于西洋参破壁饮片的定性评价分析。

表2 不同色谱柱上保留时间的线性方程及相关系数

2.6.2 双标化合物的确定 通过DRS Origin 软件的计算，筛选出了10种双标选择方案（表3），10种方案色谱柱符合率均达到95%，其中峰2～6 组合的预测正确率及色谱柱符合率均为100%，且保留时间回归偏差最小。在未知色谱柱（以col 16 为验证柱）上运行双标对照品溶液和供试品溶液，将人参皂苷Re 和人参皂苷Rb2作为西洋参破壁饮片液相色谱的双标化合物，以这2 个成分的SRT 为横坐标，实际保留时间人参皂苷Re 32.791 min、人参皂苷Rb245.833 min 为纵坐标，得到2 点人参皂苷Re（32.791、31.628）和人参皂苷Rb2（45.833、44.491），做一直线，得到方程Y=0.986 3X-0.712 9，然后将其余6 个成分的SRT 值代入方程，得到SRT：人参皂苷Rg131.116 min、拟人参皂苷F1141.078 min、人参皂苷Rb142.618 min、人参皂苷Rc 43.553 min、人参皂苷Rb344.797 min、人参皂苷Rd 46.607 min。实际保留时间依次为31.628、41.036、42.828、43.663、44.757、46.451 min。单纯定性条件下，满足预测保留时间与实测保留时间的误差应不超过0.5 min 的要求[16]，说明该双标选择在col 16 上保留时间预测效果良好。

表3 10种双标化合物选择方案

2.6.3 双标线性校正法与相对保留时间法的对比对双标线性校正法与相对保留时间法在西洋参破壁饮片液相色谱中定性的优劣进行比较。双标线性校正法以色谱图靠近两端的人参皂苷Re和人参皂苷Rb2为双标化合物，相对保留时间法以人参皂苷Rb2为参照物，表4 为在15 根色谱柱上2 种方法的比较结果，与相对保留时间法比较，双标线性校正法的保留时间预测值的绝对偏差波动范围较小且绝对偏差较低。由此可见，双标线性校正预测保留时间的准确性优于相对保留时间。

表4 不同色谱柱2种方法不同成分保留时间预测值的绝对偏差

3 讨论

3.1 检测器的选择

拟人参皂苷F11作为西洋参特征成分，母体结构为奥克娣隆型化合物，在紫外区仅有末端吸收。通过比较西洋参破壁饮片的CAD 与二极管阵列检测器（DAD）检测图谱，发现DAD 下未见相应峰，而CAD 下响应较好，指纹特征性更强且灵敏度高，基线更平稳。故选择CAD 建立西洋参破壁饮片与传统饮片的指纹图谱研究。

3.2 前处理及色谱条件的选择

本实验选用HPLC 测定皂苷类成分，对水饱和正丁醇与甲醇不同溶剂、超声与加热回流不同提取方法及提取时间等进行考察发现，甲醇超声30 min提取的供试品溶液色谱峰信息全面完整且操作简单，足以适用于对西洋参破壁饮片定性研究。所用流动相有乙腈-0.01%三氟乙酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-水等[17-18]。经实验比较发现，以乙腈-水进行梯度洗脱系统显示的图谱峰形好、基线平稳，可满足8 个皂苷类成分的分离要求，且水相较于三氟乙酸和甲酸更安全、经济又方便。

本研究采用HPLC-CAD 建立西洋参破壁饮片的指纹图谱，同时，对同批次来源的西洋参传统饮片指纹图谱的相似度进行评价分析，探究两者之间的关联性。结果显示，传统饮片与破壁饮片之间色谱峰相似度均大于0.939，各共有峰的保留时间几乎一致。这表明，西洋参传统饮片经破壁粉碎并制成破壁饮片的过程中，化学成分无明显变化，超微破壁粉碎技术并未造成传统饮片中主成分流失及新化学成分的转化或生成[19]。笔者又结合DRS Origin 软件对15 根色谱柱采集的西洋参破壁饮片数据拟合，进而对色谱峰定位，确定双标化合物，再用双标线性校正预测目标化合物的保留时间。结果与相对保留时间法相比，双标线性校正法预测定位更准确且实用方便，表明该方法在中药复杂的多指标成分定性方面有着很好的应用前景。