哈茨木霉M-17固体发酵及发酵产物浸提液对镰刀菌的抑制作用

谭娇娇，王喜刚，郭成瑾，张丽荣，沈瑞清,

(1.宁夏大学 农学院，银川 750021；2.宁夏农林科学院 植物保护研究所，银川 750002)

近年来，中国马铃薯种植面积不断扩大，加之长期连作，使得因镰刀菌(Fusariumspp.)引起马铃薯土传病害日益加剧，造成了严重经济损失[1]。这类土传病害的病原菌生活史大都发生在土壤中，从根部和茎部开始侵染[2]，在早期发病时地表上部症状不明显，不易被发现。该类病原菌传染性极强，具有较大的爆发性和毁灭性，极难防治[3]。

过去人们常使用化学农药来防治这类病害，极易造成农药残留和环境污染等问题。开发利用对非靶标生物安全、有益于环境友好的生物农药迫在眉睫。生物防治具有无污染、无公害、效益长等优点，展现出其广阔的发展前景和应用市场[4]。经研究发现，利用木霉菌等微生物资源来防治植物病虫害，既能有效抑制土传病害发生，还具有提高营养利用效率、促进植物生长、增强植物抗逆性和修复农化污染环境等功能[5-6]。

木霉(Trichoderma)是广泛存在于植物根部、土壤、海洋及植株残体中的一类真菌[7-8]，具有生命力强，适应性广等特点。据报道木霉属真菌约有250余种[9]。木霉菌在农业上应用广泛，对农作物、中草药和园林植物病害的防治都有较好的效果[10-11]。作为生防制剂在农林业使用广泛的木霉菌有哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、深绿木霉(T.atroviride)和绿色木霉(T.viride)[12]。木霉菌不仅能够在大多数植物根系中定殖和生长，还可以促进根的生长增加作物产量[13-15]。木霉的固体发酵是木霉通过利用工业或农业副产品废弃物作为培养基在一定发酵条件下生长并产生代谢产物的过程。常用的固体发酵原料有麦麸、米糠、甘蔗渣、麦粒、花生粉饼、秸秆等。有研究表明中药渣中含有微生物生长所需的营养物质[16]，纤维孔隙率高，易于菌丝的生长和繁殖。因此中药渣常用来作为食用和药用菌的培养基质[17]。本试验选择哈茨木霉M-17作为供试菌株，以中药药渣粉作为主要的培养基成分进行固体发酵，并将其发酵产物用于抗菌试验研究，以便为该菌的深入研发提供有益的试验数据并对木霉菌商品化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株 哈茨木霉M-17、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、接骨木镰刀菌(F.sam-bucinum)、木贼镰刀菌(F.equiseti)、茄病镰刀菌(F.solani)和锐顶镰刀菌(F.acuminatum)均由宁夏农林科学院植物保护研究所提供。

1.1.2 固体发酵培养基 玉米粉、葡萄酒皮渣、木屑、中药渣固体培养基：甘草、板蓝根。以上材料均购自银川农用材料市场。

1.2 方 法

1.2.1 菌株M-17与病原菌的对峙试验 将菌株M-17与病原菌分别转接于PDA固体平板，于25 ℃黑暗条件下培养5 d后，分别用打孔器(Φ=10 mm)沿菌落边缘打1块菌饼，放入PDA固体培养基中线上(一个生防菌菌饼对应一个病原菌菌饼)，两菌饼之间的距离须大于20 mm，共设置2个重复，空白对照不接入菌株M-17，于25 ℃黑暗条件下静止培养约7 d，测量菌落半径。考察M-17与病原菌的拮抗性。

1.2.2 菌株M-17的发酵 将甘草和板蓝根以及甘草+板蓝根+葡萄酒皮渣分别与玉米粉、木屑以总质量40 g为标准按比例配制培养基，甘草+玉米粉+木屑、板蓝根+玉米粉+木屑和中药渣+玉米粉+木屑均按比例5∶4∶1、7∶2∶1和3∶5∶2配制3个比例，甘草+板蓝根+葡萄酒皮渣+玉米粉+木屑按比例2∶0∶6∶4∶1、0∶2∶6∶4∶1和2∶2∶4∶4∶1分别加入250 mL三角瓶中，130 ℃高压灭菌60 min。分别接入菌株M-17的种子液或菌饼，于25 ℃下静置培养3 d，手工摇瓶(增加与养料的接触)后继续静置培养9～12 d，待菌丝长满培养基后取出，备用。

1.2.3 菌株M-17的发酵产物对病原菌的抑制效果 取1 g发酵物，烘干后粉碎，加入2 mL无菌水充分振。12 000 r/min离心10 min，将上清液过6 μm滤膜。取500 μL滤液滴于PDA培养基中，用无菌涂布棒涂布均匀，备用。用“1.2.1”的方法取病原菌菌饼，放入涂布发酵产物的PDA平板中，于25 ℃黑暗条件下静置培养。共设置9个重复，空白对照不涂抹发酵产物，9 d后测量菌落半径。观察发酵产物对马铃薯根腐镰刀菌(木贼、接骨木、尖孢、茄病、锐顶)的抑制效果。

1.3 菌落抑制率计算

以直尺取菌落互相垂直的两个直径分别读数，并以PDA固体培养基接入一块病原菌菌饼为对照，菌落抑制率=(SCK-S1)/SCK×100%，其中SCK表示对照半径距离(cm)，S1表示在PDA固体培养基上涂布生防菌发酵产物后接入病原菌菌落的处理半径距离(cm)。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2010对试验结果进行统计分析，用SPSS 26.0.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 菌株M-17与病原菌的对峙试验

由表1可知，生防菌M-17对对茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌和接骨木镰刀菌抑制效果较好，抑制率分别为66.38%、66.39%和66.18%(图1-a、图1-b、图1-c)；对锐顶镰刀菌和木贼镰刀菌的抑制效果最差，其中对木贼镰刀菌的抑制率为 57.06%(图1-e)，对锐顶镰刀菌的抑制率最低为 51.29%(图1-d)。

表1 菌株M-17对5种镰刀菌的生长影响以及抑制作用

2.2 发酵固体培养基的筛选

根据菌株M-17在含有甘草或板蓝根或葡萄酒皮渣的固体培养基的生长情况，挑选菌丝长满培养基，并且可见大量菌丝，干燥后颜色为褐色或淡褐色的培养基，筛选出1-1、1-2、1-3、2-3和4-1五种含有中药的固态培养基类型。由表2可知，甘草和板蓝根都具有促进生防菌M-17菌丝生长的能力。在相同配比情况下，板蓝根的促进效果更好，8 d菌丝就已布满培养基。但在有葡萄酒皮渣参与发酵的情况下，甘草的促进效果要好于板蓝根。

表2 菌株M-17的固态发酵效果

2.3 菌株M-17中药渣固态发酵产物的抑菌效果

不同配方接种菌株M-17发酵后，发酵产物的抑制效果随着时间的增加而提高，在第7天时抑制率普遍高于第5天和第3天。不同配方发酵下的发酵产物对每种镰刀菌的抑制效果差异显著(表3)。

表3 菌株M-17中药固态发酵产物对不同镰刀菌的抑制效果

2.3.1 对茄病镰刀菌的抑制效果 用配方1-1发酵M-17菌株7 d后，发酵产物对茄病镰刀菌抑制效果最好，抑制率为75.65%；其次是配方1-2，抑制率为73.65%；配方2-3、配方1-3和配方 4-1，抑制率分别为72.14%、70.60%和70.07%。因此配方1-1在25 ℃时发酵M-17菌株7 d对茄病镰刀菌的抑制效果最好。

2.3.2 对尖孢镰刀菌的抑菌效果 使用不同配方的发酵产物对尖孢镰刀菌的抑制效果显著，配方2-3发酵菌株M-17的发酵产物对尖孢镰刀菌的抑制率最高，为76.78%，其次为配方4-1，抑制率为75.92%，配方1-2、配方1-3和配方1-1，抑制率分别为72.91%、72.20%和69.31%。因此配方2-3在25 ℃发酵M-17菌株7 d时对尖孢镰刀菌的抑制效果最好。

2.3.3 对接骨木镰刀菌的抑菌效果 利用配方 1-3和配方4-1发酵菌株M-17，发酵7 d后的发酵产物对接骨木镰刀菌的抑制效果无显著差异，抑制效果都较好，抑制率分别为67.61%和 67.20%。其次是配方1-1，抑制率为67.05%，配方1-2和配方2-3，抑制率分别为65.32%和 61.31%。综上，配方1-3在25 ℃发酵M-17菌株7 d时对接骨木镰刀菌的抑制效果最好。

2.3.4 对锐顶镰刀菌的抑菌效果 配方1-2和配方1-1发酵菌株M-17的发酵产物对锐顶镰刀菌的抑制效果无显著差异，但较其他3种配方，抑制效果差异显著，抑制率分别为68.72%和 67.66%。其次是配方1-3、4-1和2-3，抑制率分别为67.57%、63.08%和61.80%。综上，配方 1-2在25 ℃发酵M-17菌株7 d时对木贼镰刀菌的抑制效果最好。

2.3.5 对木贼镰刀菌的抑菌效果 配方1-3、2-3和配方4-1固态发酵菌株M-17，发酵7 d后，发酵产物对木贼镰刀菌的抑制效果没有显著性差异，抑制率分别为78.45%、77.99%和77.86%，配方1-3与配方1-2和配方1-1有显著性差异，抑制率分别为77.19%和76.89%。综上，配方1-3在 25 ℃发酵M-17菌株7 d时对木贼镰刀菌的抑制效果最好。

3 讨 论

研究表明木霉对马铃薯的土传病害有良好的防治作用。Wharton等[18]利用哈茨木霉防治马铃薯晚疫病，使得晚疫病发病率降低30%～45%。Kahkashan等[19]分离的哈茨木霉TvDPs、TDPs和T1s3种菌株对尖孢镰刀菌的抑制率分别为66.3%、57.4%和56.4%。潘潇涵等[20]研究表明哈茨木霉VT9-3r对尖孢镰刀菌、茄链格孢的抑制率分别为64.0%和60.2%。本试验利用哈茨木霉M-17与病原菌尖孢镰刀菌、接骨木镰刀菌、木贼镰刀菌、茄病镰刀菌和锐顶镰刀菌分别进行对峙试验，研究发现哈茨木霉M-17对尖孢镰刀菌的抑制率最高，为66.39%；对锐顶镰刀菌的抑制率最低，为51.29%。因木霉菌的作用机制多样，同一种木霉对不同病原菌的作用机制也存在差异[11]，故对不同病原菌的抑制效果也 不同。

木霉菌的固体发酵大多使用工业或农业废弃物作为发酵培养基质。陈燕萍等[21]以微生物发酵床养猪垫料发酵地衣芽孢杆菌，曾才庆等[22]用哈茨木霉FJAT-9040发酵。常用的固体发酵原料有麦麸、米糠、甘蔗渣、麦粒、花生粉饼、秸秆等。近年来中药渣也渐渐应用到微生物的发酵中。杨丽红等[23]利用中药渣发酵亮菌进行研究，结果表明供试的中药渣固体发酵培养基发酵亮菌均可产漆酶，且在优化培养条件后漆酶的酶活提高了19倍。本次试验利用甘草、板蓝根、葡萄酒皮渣和中药渣(30%甘草药渣粉、10%板蓝根药渣粉和60%葡萄酒皮渣)与玉米粉和木屑按照不同的比例配制成不同固体培养基。通过观察木霉菌的发酵效果发现，发酵8～9 d时菌丝基本长满，部分有结团现象。其中发酵效果明显的配方有：甘草、玉米粉和木屑配比为5∶4∶1、7∶2∶1和3∶5∶2；板蓝根、玉米粉和木屑配比为3∶5∶2；甘草、板蓝根、葡萄酒皮渣、玉米粉和木屑配比为2∶0∶6∶4∶1。对比不同发酵培养基的发酵结果发现，甘草和板蓝根在菌株M-17发酵过程中促进菌丝生长效果明显。将这几种配方发酵M-17的发酵产物分别用于病原菌的抗性试验，结果表明不同配方接种M-17发酵后，发酵产物对病原菌的抑制率在第7天时均较高，但每种配方对不同病原菌的抑制率有差异。这几种配方发酵M-17的发酵产物对尖孢镰刀、茄病镰刀菌和木贼和镰刀的抑菌率达70%以上，其中对木贼镰刀菌的抑制率最高，达到了78.45%。

经试验观察发现，木霉发酵时不同固体培养基基质所需的水分、pH以及不同菌种的培养温度等条件均会影响菌株生长和代谢产物的产生[21]。本次试验还未对发酵条件进行全面的优化，但结果显示中药渣发酵哈茨木霉M-17的发酵产物对部分马铃薯土传病害病原菌的抑制效果良好。优化固体发酵条件之后预估会提高发酵产物的质量，增加对病原菌的抑制率。