结石性胆囊炎患者胆囊黏膜组织Hp DNA及CagA和CCK-AR表达研究*

熊茂程，雷艳梅，李良敏，李 杨

胆囊黏膜化生主要有幽门腺化生和杯状细胞化生，均属肠型化生。66%～84%胆囊切除组织可见幽门腺化生，12%～52%因结石性胆囊炎切除的胆囊组织可见杯状细胞化生[1]。目前，大部分国内外学者认为化生是胆囊异型增生的前期病变，胆囊黏膜可由化生发展为异型增生，最后发展为癌[2，3]。胆囊癌具有恶性程度高、预后差等特点，且发病隐匿，早期诊断困难，故深入分析胆囊炎和胆囊癌发病机制，对防控疾病有利[4]。幽门螺杆菌(helicobacter pylori，Hp)是与胃炎和胃癌密切相关的致病菌。虽然Hp是一种专性微需氧菌，但体外实验发现，Hp暴露于5%胆汁培养基中30 min，75%Hp可存活，提示Hp可能在通过十二指肠时仍存活，并逆行定植于胆囊内[5]。近年研究也发现，Hp可能产生毒素，并诱导黏膜炎性反应，损害胆囊黏膜屏障，参与胆囊黏膜上皮细胞变性和坏死等过程[6]。本研究从分子生物学角度分析了Hp DNA及其毒素基因与结石性胆囊炎患者胆囊黏膜病变的关系，以评估Hp感染与结石性胆囊炎发病的关系及其可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2019年1月～2020年12月我院收治的结石性胆囊炎患者98例，男41例，女57例；年龄为24～66(50.3±11.2)岁。经影像学检查诊断，行择期胆囊切除术。排除标准：⑴合并胆囊癌或其他恶性肿瘤、胆囊穿孔或积脓；⑵曾接受过胆道手术；⑶慢性胆囊炎急性发作；⑷合并肝脏、心血管等其他脏器严重疾病。患者及其家属签署知情同意书，本研究获得我院医学伦理委员会审批。

1.2 胆囊组织超微结构检查 取胆囊黏膜组织，切成1.0 mm×1.0 mm×2.0 mm的小块，用0.9%等张氯化钠溶液清洗，经4%戊二醛固定，用PBS清洗，以锇酸固定1 h。用乙醇脱水，用EPON 812和815树脂混合包埋，经超薄切片机(瑞典LKB，8800-Ⅲ型)切片，用阿利新蓝-过碘酸雪夫行组织化学染色(染色液由南京森贝伽生物科技有限公司提供)，在透射电镜下观察胆囊黏膜组织学表现和细胞分泌黏液特点，并根据病理学分型特点将其分为单纯性增生(上皮细胞排列紧密，细胞间有间隙，细胞大小均匀且侧面呈高柱状)、肠型化生(上皮细胞轻度变性，细胞表面可见分泌颗粒，也可见聚集的球状黏液颗粒)和异型增生(成片上皮细胞破溃、糜烂，上皮下大量胶原纤维呈网状或束状排列，部分上皮细胞再生增殖，增生细胞排列紧密且大小不一、折叠呈结节状)。

1.3 胆囊组织Hp DNA检测 取胆囊黏膜组织0.5×1.0×0.5 cm3，与提取液200 μL混合，经55℃水浴12 h，95℃水浴15 min，1500 r/m离心5 min。使用等体积酚/氯仿抽提DNA，采用PCR法扩增检测Hp DNA。引物序列上游为5′-CATCTCCCCCAACAAAT

C-3′，下游为5′-TTCACCCACACGACCCATA-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成和纯化。反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环。最后，72℃延伸10 min，在1%琼脂糖凝胶电泳分析产物。

1.4 胆囊组织基因检测 取胆囊黏膜组织，加入Trizol提取液(美国Invitrogen公司)提取总RNA，测定A260/A280值，计算总RNA浓度。取RNA 2μL，用试剂盒(上海科华生物技术公司)逆转录成cDNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)即用型试剂盒制备PCR体系25μL，将制备完成的PCR反应管置入实时荧光定量PCR仪内，检测以下基因：细胞毒素相关基因A(cytotoxin-associated gene A，CagA) mRNA，引物序列上游为5′-GATAACAGGCAAGCTTTGAGG-3′，下游为5′-CTGCAAAGATTGTTTGCGAGA-3′；胆囊收缩素-A受体(cholecystokinin-A receptor，CCK-AR) mRNA，引物序列上游为5′-CACCATGTCCATCCACTTCA-3′，下游为5′-CTTGATCTGCTCGCTCTCCT-3′；β-actin引物序列为上游5′-CCATCGTCCACCGCAAAT-3′，下游5′-CCTGTAACAACGCATCTCATA-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成和纯化。反应条件为95℃预变性4 min，95℃变性60 s，50℃退火60 s，72℃延伸60 s，共30个循环。最后，72℃延伸5 min，以β-actin为内参，使用凝胶成像系统摄像，采用2-ΔΔCt法定量，以目的基因与β-actin比值作为目的基因mRNA相对水平。

1.5 胆囊组织磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)活性检测 取胆囊黏膜组织，加入稀释液4 mL，用玻璃匀浆器匀浆，60℃水浴30 min，置于4℃保温箱内。采用盐酸滴定法计算PLA2活性，1个 PLA2活性单位为37℃下1 min、1 mL样本反应消耗1nmol盐酸的量。

2 结果

2.1 三组胆囊黏膜Hp DNA阳性检出率比较 在本组98例结石性胆囊炎患者中，经电镜检查，发现单纯性增生33例，肠型化生45例，异型增生20例；在单纯性增生组，胆囊黏膜Hp DNA阳性10例(30.3%)，肠型化生组18例(40.0%)，异型增生组10例(50.0%)，三组胆囊黏膜Hp DNA阳性率比较，差异无统计学意义(x2=2.103，P=0.40)。

2.2 三组胆囊黏膜CagA、CCK-AR mRNA相对水平和PLA2活性比较 异型增生组胆囊组织CagA mRNA相对水平和PLA2活性显著高于其他两组(P<0.05)，而CCK-AR mRNA相对水平显著低于其他两组(P<0.05，表1)。

表1 三组胆囊黏膜CagA、CCK-AR mRNA和PLA2活性比较

3 讨论

在正常状态下，Oddi括约肌可抑制细菌侵袭和繁殖，健康人胆道常处于无菌状态[7]。然而，研究发现细菌可经门静脉系统入侵胆道，引起感染。细菌可分泌β-葡萄糖醛酸酶，促进胆红素钙盐沉积，形成胆色素类结石，参与胆结石的形成[8]。作为上消化道感染的主要细菌，Hp可产生CagA等毒素和磷脂酶等具有毒性作用的酶，对胃黏膜屏障形成损害[9]。Hp可在上消化道长期或暂时存在，并经Oddi括约肌逆流进入胆道系统[10]，但Hp感染是否与结石性胆囊炎的发生发展有关，目前仍存在争议。本研究中，胆囊粘膜单纯性增生组、肠型化生组和异型增生组Hp DNA阳性率分别为30.3%、40.0%和50.0%，提示结石性胆囊炎患者胆道系统确实存在明确的Hp感染，与有关报道一致[11]。但三组胆囊黏膜Hp DNA阳性率比较无显著性差异，考虑该结果一方面与Hp感染在胆囊黏膜组织病理学改变过程中发挥的作用仍不清楚，另一方面与本研究样本量较小，导致结果未出现显著性差异[12]。

CagA蛋白是Hp CagA基因编码的产物，在Hp感染引起炎性反应过程中发挥效应蛋白的作用，它还可调控多种信号通路，诱导细胞过度增殖、凋亡抑制、迁徙能力增强等异常生物学行为，促进细胞癌变[13，14]。另有报道指出[15]，Hp致病性与细菌毒力因子和宿主细胞应答等因素相关。CagA等毒素表达水平在Hp致病过程中发挥关键的作用。在本研究中，胆囊黏膜CagA mRNA相对水平在单纯性增生组、肠型化生组和异型增生组逐渐升高，结石性胆囊炎患者胆囊黏膜病变与胆囊黏膜CagA mRNA相对水平呈显著正相关，这也说明Hp感染可能参与了结石性胆囊炎的胆囊黏膜病变的发展，随着胆囊黏膜病理学损害程度的加重，Hp的致病性也变得明显。另外，Hp具有高于其他细菌的PLA2活性。PLA2是前列腺素合成的限速酶，而前列腺素E2可刺激胆囊炎症反应，诱导胆囊黏膜分泌糖蛋白，促进结石形成，故Hp感染还可能通过增加PLA2活性，促进胆结石的形成[16，17]。本研究也发现，结石性胆囊炎患者胆囊黏膜病变与胆囊黏膜PLA2活性呈显著正相关，提示Hp感染可能通过增加PLA2活性，促进胆囊炎症增强及结石的形成，加速胆囊黏膜病变的进程。

另据文献报道[18]，结石可引起胆囊收缩功能下降，而CCK-AR表达降低与胆囊收缩功能下降有关，进而可引起胆汁淤积和结石的形成，加剧结石性胆囊炎的病情进展。在本研究中，胆囊黏膜CCK-AR mRNA相对水平在单纯性增生组、肠型化生组、异型增生组中逐渐降低，结石性胆囊炎患者胆囊黏膜病变与胆囊黏膜CCK-AR mRNA相对水平呈显著的负相关，与上述报道相似。近年研究也发现[19]，Hp感染能降低胆囊壁CCK-AR表达能力，降低CCK-AR敏感性，导致胆囊收缩功能进一步降低。因此，Hp感染还可能经抑制CCK-AR表达等方式，参与结石性胆囊炎患者胆囊黏膜病变的进展。

此外，结石性胆囊炎患者胆囊黏膜病变与年龄等因素相关[20]。有研究指出[21]，随年龄的增长，结石性胆囊炎患者胆囊黏膜由肠型化生发展至异性增生耗时约为3年，黏膜病变可随年龄的增加而更为严重。但本研究仅将年龄作混杂因素分析，未对胆囊黏膜病变与Hp感染的关系行年龄分层研究，也是本文存在的缺陷之一。为保证结论的科学性和严谨性，今后还需针对不同年龄层患者的胆囊黏膜病变和Hp感染情况作进一步的探究。

综上所述，Hp感染可能通过增加CagA毒素表达、上调PLA2活性和抑制CCK-AR表达等方式，参与结石性胆囊炎患者胆囊粘膜病变的发生发展，促进胆囊黏膜病变恶化。结石与胆囊炎的关系、胆囊炎与癌变的关系以及各基因在这个复杂的过程中的相互作用，仍需要深入研究。由于胆囊炎患者多存在多种基础疾病，包括高脂血症、高血压、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病和心脑血管疾病等，以及在处理这些复杂疾病过程中的用药问题，都将影响胆囊粘膜病变的最终转归，这些都需要认真研究。