基于UPLC-Q-TOF-MS/MS结合网络药理学的壮腰通络方延缓腰椎间盘退行性病变的化学成分及作用机制研究

孙凯，朱立国，2*，魏戌*，银河，李秋月，秦晓宽，杨博文

本研究创新性：

本研究采用超高效液相色谱法—四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术初步阐明了壮腰通络方中包含的化学成分，并进一步结合网络药理学方法解析了其药效靶点、生物途径及作用机制，为该方深入的药效物质基础和作用机制研究提供了参考依据。

本研究局限性：

壮腰通络方中包含的化学成分十分复杂，通过高分辨质谱技术鉴定出的化学成分仍十分有限，且未明确鉴定出的化学成分是否均能进入体内发挥药理作用。此外，尽管开展了网络药理学的预测分析，初步阐明了其可能的作用机制，但未能结合关键靶点及信号通路进行实验验证。

腰椎间盘退行性病变（lumbar intervertebral disc degeneration，LIDD）是导致腰椎退行性疾病发生的最重要的病理基础。随着社会老龄化的加剧，腰椎退行性疾病已成为严重危害人们生命健康的重大慢性疾病，且患病率呈现逐年上升的趋势[1-2]，该类疾病具有迁延难愈、复发率及致残率高等临床特点。研究表明，2013年中国人群腰背痛所致伤残损失寿命年为1 634.7万人年，是中国人群伤残负担的第一原因，给人们带来了极大的经济负担和精神压力[3]。LIDD是该类疾病发生的核心环节，其病理机制涉及炎症刺激、免疫应答、细胞凋亡等多种复杂生物学过程，因此，如何有效延缓椎间盘退变进程是国内外研究的热点与难点[4-6]。

壮腰通络方为首都名中医朱立国教授基于长期临床实践凝练的有效经验方。前期临床观察表明其能有效缓解腰椎间盘突出症患者腰膝酸软、疼痛不适等症状及改善日常活动受限等功能评分，4周治疗有效率达82.22%，具有较好的安全性[7]。但在完成临床疗效观察的基础上，该方潜在的药效物质基础尚不清楚，且药物的作用靶点、生物途径及作用机制也未阐明。近年来，超高效液相色谱法—四极杆飞行时间串联质谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC-QTOF-MS/MS）技术及网络药理学迅猛发展。UPLC-QTOF-MS/MS为快速鉴定中药复方中所包含的已知化学成分及发现未知的化合物提供了有力的技术支撑，目前已广泛应用于中药化学成分检测和表征的分析[8-10]。网络药理学在系统阐释中药复方、单味药靶标及作用机制，解析药物组合规律及中药功效异同，了解疾病和证候的生物学基础等方面发挥了重要作用，尤其是广泛应用于中药复方机制研究，为明确中药复方多成分、多靶点、多途径的分子作用机制提供了研究平台[11-12]。

因此，本研究拟采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合网络药理学方法，基于“成分—靶点—通路”的网络模式，初步揭示壮腰通络方的有效成分及其治疗LIDD的潜在作用机制，为该方进一步的实验研究及临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究时间 2020年。

1.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS实验仪器与试剂药品

1.2.1 实验仪器 液相系统为日本岛津超高效液相色谱仪（Shimadzu LC30），质谱系统为SCIEX 5600+质谱仪（美国，AB Sciex Instruments，型号TripleTOF 5600+，Hybrid Quadrupole-TOF LC/MS/MS Mass Spectrometer），CPA225D电子分析天平〔赛多利斯科学仪器（北京）有限公司〕，SC-3160低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），ALC-M Tissue—Organ Bath System（上海奥尔科特生物科技有限公司）等。

1.2.2 试剂药品 色谱纯甲醇、质谱级甲醇、色谱级乙腈、质谱级乙腈〔购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司〕；分析纯95%乙醇、分析纯甲醇（北京化工厂）；甲酸为质谱纯（美国Sigma公司）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）等。壮腰通络方（由杜仲15 g、熟地黄15 g、当归12 g、丹参12 g等9味中药组成）药物购于中国中医科学院望京医院，经鉴定为合格药材，饮片质量符合《中华人民共和国药典》2015年版（第十版）有关规定[13]。松脂醇二葡萄糖苷（批号：111537-201706，规格：20 mg）、地黄苷D（批号：112063-202001，规格：20 mg）、阿魏酸（批号：110773-201915，规格：50 mg）、丹参酮ⅡA（批号：110766-201721，规格：20 mg）等标准对照品均购于中国食品药品检定研究院（均符合国家药品标准物质）。

1.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS实验方法

1.3.1 壮腰通络方供试品及对照品溶液制备 按照标准的汤剂提取工艺方法，将壮腰通络方的中药饮片放入容器内，加入8倍生药量去离子水，充分浸泡30 min，大火煮沸后改小火煎煮40 min沥出药液至清洁容器，再次加入6倍药量重的去离子水煎煮40 min滤出药液，将两次煎煮获得的药液混匀得到最终提取滤液，随后采用旋转蒸发仪减压浓缩至小体积，用去离子水定容至生药浓度0.1 g/ml，13 000 rpm离心15 min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后进样分析。标准对照品溶液制备：用精密天平分别称取标准对照品5 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇各自溶解、摇匀，定容，得到各标准对照品溶液母液，根据需要再用甲醇稀释为所需浓度。

1.3.2 色谱条件和质谱条件 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC X Bridge® BEH C18 Column 2.5 μm，2.1 mm×50 mm；流动相：A为0.1%甲酸-水，B为乙腈，洗脱程序见表1。体积流量0.3 ml/min；柱温为35 ℃，进样器温度为4 ℃，进样量为10 μl。质谱条件：质谱采用正/负离子模式（ESI+/-）、IDA模式，扫描范围m/z 50～1 500，扫描时间0.2 s，碰撞电压为35 V，毛细管电压为4 500 V（负离子）和5 500 V（正离子），离子源温度为400 ℃（负离子）和550 ℃（正离子），去簇电压为60 V。气帘气流量为25 L/min，Gas1和Gas2气流量均为50 L/min，气体均为氮气。

表1 梯度洗脱程序信息Table 1 Gradient elution program information

1.3.3 数据分析 基于质谱数据库，通过供试品中一级质谱的准分子离子峰的比对，以及二级质谱数据的解析，对复方供试品中的化学成分进行鉴定，通过对照品对鉴定的化学成分进一步确定。采用Peakview 2.2软件采集和处理数据，将主要色谱峰的精确相对分子质量与自建的化学成分信息库进行比对，推测各化合物的分子式，结合对照品质谱碎片信息对色谱峰进行指认和归属。

1.4 网络药理学的分析方法

1.4.1 数据库与软件 使用的网络数据库或软件主要包括中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[14]，PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[15]，SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）[16]，GeneCards® Version 5.0：The Human Gene Database（https://www.genecards.org/）[17]，OMIM®-Online Mendelian Inheritance in Man®（https://www.omim.org/）[18]，DisGeNET Database（http://www.disgenet.org/web/DisGeNE）[19]，Uniprot Database（http://www.uniprot.org/）[20]，Metascape（https://metascape.org/gp/index.html），pharmGKB Database（https://www.pharmgkb.org/），STRING 11.0（https://string-db.org/），Venny 2.1在 线 软 件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），NCBI GEO（Gene Expression Omnibus，GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），Cytoscape 3.5.1软件等。

1.4.2 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析壮腰通络方化学成分及靶点预测 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析获得壮腰通络方化学成分，并结合文献及数据库最终确认。随后逐一查询化合物的SMILE结构，在SwissTargetPrediction数据库通过配体结构预测成分作用靶点，与TCMSP中收集的化合物的靶点进行对照，最终确定药物潜在靶点全称，随后通过Uniprot数据库对靶点蛋白名称进行标准化，选择物种为“Homo Sapiens”，获得唯一的Unipot ID号，去除重复后即得到每个药物及成分的潜在作用靶点。

1.4.3 LIDD疾病靶点获取 LIDD疾病靶点的收集来源于GeneCards®数据库、DisGeNET数据库、OMIM®数据库、pharmGKB数据库、NCBI GEO数据库，通过这些数据库收集挖掘疾病靶点并进行标准化处理，获得唯一的Unipot ID号，即得到LIDD疾病靶点。

1.4.4 壮腰通络方治疗LIDD的网络构建及关键靶点获取 在获得药物成分及其靶点后，通过Cytoscape 3.5.1软件构建中药—活性成分—药物靶点的可视化网络图。同时，通过软件将中药预测的靶点与疾病的靶点进行映射，获得壮腰通络方治疗LIDD的交集靶点。

1.4.5 靶点蛋白与蛋白互作网络分析（protein-protein interaction analysis，PPI） 将获得的共有靶点上传至在线STRING 11.0数据库，选择类型为“Homo Sapiens”，设置参数评分值>0.4，其他参数为默认设置，同时去掉PPI网络中的孤立蛋白，导出PPI分析结果，并提取其网络中的核心靶点蛋白。

1.4.6 靶点基因本体论（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG） 通路富集分析通过Metascape在线软件中Geneenrichment富集分析对获取关键靶点的生物学过程进行分析，主要包括生物过程（biologicalprocess，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）、细胞成分（cellularcomponent，CC）三个类别，获得富集分析的结果（P<0.05）。然后通过Cytoscape 3.5.1软件中的“ClueGO”插件对获得的关键靶点进行KEGG信号通路富集分析，获得显著富集的信号通路（P<0.05）。

2 结果

2.1 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术的壮腰通络方化学成分 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对复方供试液及对照品溶液进行了正离子、负离子全扫描，获得正、负离子模式下的总离子色谱图，见图1。根据色谱信息（色谱峰保留时间、紫外吸收特征等）和质谱信息（精确相对分子质量、二级质谱裂解碎片等）与对照品比对，并结合文献分析，共鉴定出壮腰通络方中129种化学成分，其中正离子模式下获得98种，负离子模式下获得31种。化学成分包括丹酚酸A、丹酚酸B、阿魏酸、芥子酸、大黄酚等多种酚酸类化合物，丹参酮ⅡA、去氢丹参酮ⅡA、异丹参酮Ⅱ等多种醌类化合物，洋川芎内酯K、洋川芎内酯N等多种苯酞内酯类化合物，具体见表2。

图1 壮腰通络方总离子流Figure 1 Total ion flow of Zhuangyaotongluo decoction

表2 壮腰通络复方化学成分鉴定结果Table 2 Chemical constituents identified in Zhuangyaotongluo decoction

（续表2）

（续表2）

（续表2）

2.2 LIDD疾病靶点获取 通过GeneCards®数据库、DisGeNET数据库、OMIM®数据库、pharmGKB数据库、NCBI GEO数据库分别获得LIDD疾病靶点1 123个、2个、5个、5个、1 868个，经过标准化去重后获得2 873个，即为LIDD相关疾病靶点。

2.3 壮腰通络方—活性成分—药物靶点网络构建及疾病靶点与药物靶点映射 通过Cytoscape 3.5.1软件构建基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析的壮腰通络方—活性成分—药物靶点的可视化网络图，经过筛选共获得壮腰通络方中9味药物包含的129种化学成分，其对应的药物成分靶点共203个，见图2；通过软件对LIDD疾病靶点与药物靶点进行映射，获得96个壮腰通络方治疗LIDD的作用靶点，见图3。

图2 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析的壮腰通络方—活性成分—药物靶点可视化图Figure 2 Visualization of Zhuangyaotongluo decoction—active ingredients—action targets based on UPLC-Q-TOF-MS analysis

图3 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术的壮腰通络方活性成分靶点——疾病靶点韦恩图Figure 3 Venn diagram of active ingredient targets of Zhuangyaotongluo decoction based on UPLC-Q-TOF-MS analysis

2.4 PPI网络分析 将获得的96个交集靶点上传至STRING 11.0在线数据库形成PPI互作网络，获得相应的相互作用信息，见图4，并根据Count值提取了网络中的关键靶点蛋白，主要包括丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、胰岛素蛋白（INS）、白介素6（IL-6）、原癌基因蛋白（FOS）、胱天蛋白酶3（CASP3）等，列举了排名前30的关键蛋白，见图5。

图4 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析的壮腰通络方治疗LIDD的PPIFigure 4 PPI network of Zhuangyaotongluo decoction for LIDD based on UPLC-Q-TOF-MS analysis

图5 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析的壮腰通络方治疗LIDD的PPI关键靶点（排名前30）Figure 5 The key targets of PPI network of Zhuangyaotongluo decoction in the treatment of LIDD based on UPLC-Q-TOF-MS analysis（top 30）

2.5 GO生物功能注释 通过Metascape在线软件对关键靶点的生物学过程进行了分析，共确定了1 022条BP信息，主要包括平滑肌的适应性、对发热的积极调节、发热的调节、前列腺增生、发热生成等；28条CC信息，主要包括过氧物酶体、微生物、细胞膜上的膜筏、膜微域、膜区等；51条MF信息，主要包括一氧化二氮合成酶调节器的活性、RNA聚合酶Ⅱ转录辅助因子的结合、转录辅激活剂结合、核受体活动、转录因子活性、直接配体调节序列特异性DNA结合等。见图6。

图6 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析的壮腰通络方治疗LIDD的GO富集分析（排名前10）Figure 6 GO enrichment analysis of Zhuangyaotongluo decoction for LIDD based on UPLC-Q-TOF-MS analysis in terms of information regarding biological process，cellular components and molecular function（top 10）

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析共确定了98条相关信号通路，其条目中主要包括的信号通路为：HIF-1 signaling pathway，JAK-STAT signaling pathway，Relaxin signaling pathway，p53 signaling pathway，MAPK signaling pathway，Fc epsilon RI signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，TNF signaling pathway，AMPK signaling pathway等（P<0.05）。见图7。

图7 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析的壮腰通络方治疗LIDD的KEGG通路富集分析Figure 7 KEGG analysis of signaling pathways of Zhuangyaotongluo decoction for LIDD based on UPLC-Q-TOF-MS analysis

3 讨论

中药复方的化学成分十分复杂，具有多成分、多靶点、多途径协同作用的特点，因此，在临床疗效确切的基础上，解析复方药效物质基础及阐明其作用机制一直是中医药研究的重点与难点，也是促进中药新药研发及推动中医药现代化和国际化面临的艰巨挑战[21-22]。近年来，越来越多的学者将UPLC-Q/TOF-MS/MS技术与网络药理学方法有机结合起来，尤其在中医药研究领域中更为显著[23-24]。UPLC-Q/TOF-MS/MS技术的应用，为全面、精准、快速地阐明复方及其包含的化学成分提供了强有力的保障。LI等[25]对高效液相色谱/质谱联用技术在中药成分分析、代谢物分析、药动学等方面的应用进行了综述，发现其中50%的文献涉及中药化学成分分析，表明该领域目前研究最多。而以网络化、系统化为特征的网络药理学研究与中医药整体观念不谋而合，其广泛应用于包括中药靶点预测、活性化合物筛选、中药方剂网络调控机制等中医药领域研究中，在探索复杂生物学过程中发挥着至关重要的作用[26-27]。

本研究采用UPLC-Q/TOF-MS/MS技术与网络药理学相结合的方法，分析临床有效方剂壮腰通络方的化学成分并探讨其延缓LIDD的作用机制。研究发现，壮腰通络方具有多种药物包含同一个成分，不同成分存在相同靶点及多靶点、多途径作用特点。在质谱技术分析获得的129个化学成分中，如果按照口服生物利用度≥30%、类药性指数≥0.18的标准进行筛选，符合要求的化学成分仅38个。因此，既往的网络药理学分析仅依靠这两个参数的筛选，是否会因为筛选参数阈值过高而将可能发挥药效作用的化学成分过滤掉，这些化学成分是否均能顺利进入胃肠道吸收或者成为入血成分，仍有待于进一步深入研究。另外，在本研究分析获得的有效成分中，桃叶珊瑚苷、丹酚酸B等化学成分已通过实验证实能够有效延缓椎间盘退变，其与炎症抑制、免疫调节等作用机制密切相关[28-29]，壮腰通络方中的其他化学成分也包含抗炎、止痛、抗细胞凋亡、抗氧化应激、延缓衰老等药理功效[30-31]。这些均可以作为今后体内外干预试验中重点关注的化学成分。

从PPI蛋白相互作用关系的结果来看，关键靶点AKT1是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶蛋白，能够调控细胞的增殖和分化，参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的生物学过程，其参与介导的相关信号通路在椎间盘退变中发挥重要作用[32]。IL-6作为IL家族中最重要的炎性细胞因子，是椎间盘退变过程中炎症发生和参与的重要递质，值得在研究中密切关注[33]。从GO富集分析和KEGG通路富集分析来看，涉及的生物学过程主要包括对miRNA基因沉默中涉及的miRNA产生的负调控，细胞组成主要包括细胞质膜、细胞器膜等；分子功能主要包括RNA聚合酶Ⅱ转录辅因子结合、转录辅激活剂结合、核受体活性、转录因子活性等。KEGG信号通路主要集中在炎症、血管生成、细胞凋亡、转化因子等相关信号通路。WU等[34]采用HIF-1alpha敲除小鼠模型证实缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）通过HIF-1α/血管内皮生长因子（VEGF）信号通路对髓核细胞存活和细胞外基质内环境调节起关键作用，在椎间盘退变的发生、发展中起重要作用。CHEN等[35]采用人和大鼠中的髓核组织标本证明了IL-21参与了椎间盘退变的病理过程，其可通过STAT信号通路刺激TNF-α，从而加重椎间盘退变。Janus激酶（JAK）/转导和转录激活因子（STAT）信号通路是一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡及免疫调节等许多重要的生物学过程。总之，壮腰通络方可能是通过介导这些关键信号通路来发挥治疗作用的，有待于未来进一步结合关键靶点进行体内外试验验证。

综上所述，本研究通过UPLC-Q-TOF-MS/MS技术初步阐明了壮腰通络方中包含的化学成分，并结合网络药理学方法从多个角度探索了其延缓LIDD的潜在分子机制，明确了其药效关键靶点及信号通路，为该方进一步的药效物质基础和作用机制研究提供了参考依据。

作者贡献：孙凯负责文章撰写与修改；秦晓宽、杨博文进行实验操作及制图；银河、李秋月指导实验操作，负责数据核对；朱立国、魏戌负责研究的设计与可行性分析，对文章进行质量把控及审校，整体负责。

本文无利益冲突。