海南省白沙黎族自治县2020年新生儿地中海贫血基因携带情况及其特点分析

石海杰，赵振东

地中海贫血（thalassemia，以下简称地贫）又称为海洋性贫血，是最常见的单基因常染色体隐性遗传病，主要包括α地贫和β地贫两种类型。其共同特点是由于机体血红蛋白α链或β链合成减少，使红细胞不能携带足够的氧气，导致患者幼儿时期便有贫血相关症状出现并持续终生[1]，多数患者病症为慢性进行性溶性贫血[2]。部分特定人群少样本量研究[3-5]已经证实海南省是地贫的高发地区，但县级以上规模人群地贫基因筛查相关的报道较少，因此，现将涵盖白沙黎族自治县（以下简称白沙县）新生儿地贫基因携带情况及其特点报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取在海南省白沙县各助产单位2020年出生的新生儿作为研究对象，采取知情同意自愿原则，即所有新生儿监护人签署了知情同意书后再进行样本采集。在932例新生儿当中共收集到912例样本，其中男507例、女405例。本研究经海南省妇女儿童医学中心伦理委员会审核批准〔伦申第（028）号〕。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集 按照《新生儿疾病筛查血片采集技术规范》（WS376.3-2013）要求，采集出生满3～20 d 的新生儿足跟血，垂直滴于新生儿筛查采集卡上制成直径>5 mm的3～4个血斑，自然晾干后的干血斑密闭封口袋内置于2～8 ℃冰箱暂存，定期送至海南省新生儿疾病筛查中心待检。

1.2.2 实验仪器和试剂

1.2.2.1 实验仪器 SLAN-96S全自动定量PCR仪（上海宏石医疗科技有限公司），Lab-Aid824s全自动DNA提取仪（厦门致善生物科技股份有限公司），HB-2012A医用核酸分子杂交仪（广州凯普医药生物科技有限公司），2081Panthera-PuncherTM9型打孔仪（芬兰铂金埃尔默有限公司），721G分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2.2.2 实验试剂 （1）地贫基因检测试剂：熔解曲线法α地贫试剂盒、非缺失α地贫试剂盒、β地贫基因试剂盒及Lab-Aid824s核酸提取Micro试剂盒（厦门致善生物科技股份有限公司）。（2）地贫基因验证试剂：血液基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）和α、β地贫基因检测试剂盒（PCR+导流杂交法）（广州凯普医药生物科技有限公司），α地贫试剂盒（PCR法）、非缺失α地贫和β地贫基因试剂盒（PCR+反向杂交法）（深圳亚能生物技术有限公司）。

1.2.3 基因检测方法

1.2.3.1 基因检测实验 打孔仪打下6～8个直径3 mm的干血斑置于离心管中，使用磁珠法提取干血斑DNA，然后使用熔解曲线法对所提取到的DNA进行检测，检测范围涵盖试剂盒所能检出的地贫基因型。

1.2.3.2 基因验证实验 再次使用打孔仪打下6～8个直径3 mm的干血斑置于离心管中，柱状法提取DNA，然后使用凯普地贫基因试剂盒和亚能基因试剂盒进行地贫基因验证。

1.2.3.3 新基因型验证 熔解曲线法地贫基因试剂盒提示的未知突变样本外送基因公司进行基因型分析。

1.2.3.4 结果判读 严格按照每种地贫基因试剂盒说明书进行标准化判读。

1.3 质量控制 （1）干血斑样本验收：合格的干血斑要双面渗透均匀，不能受到化学制剂的污染，不能风干或晒干。信息记录完整，血斑不能有血凝块。（2）提取DNA浓度纯度验证：依据试剂说明书，DNA样本的OD260nm/OD280nm应在1.6～2.0。（3）实验操作：每个步骤严格按照试剂说明书和设备使用程序进行，每批实验各设立阴性对照和阳性对照。

1.4 观察指标 出生人数、筛查人数、检出地贫人数、筛查率、检出率。

1.5 统计学方法 采用 SPSS 13.0统计软件对数据进行描述。计数资料以相对数表示。

2 结果

2.1 海南省白沙县2020年新生儿地贫基因筛查基本情况白沙县2020年地贫基因筛查率为97.9%；共检出地贫基因异常608例，海南省白沙县地贫基因携带率为66.7%。在340例汉族检测人群中检出地贫175例，汉族地贫基因携带率为51.5%；在540例黎族检测人群中检出地贫414例，黎族地贫基因携带率高达76.7%；在32例其他少数民族检测人群中检出地贫19例，其他少数民族地贫基因携带率为59.4%，不同民族地贫基因筛查情况详见表1。

表1 海南省白沙县2020年新生儿地中海贫血基因筛查情况Table 1 Basic situation of neonatal thalassemia gene screening in Baisha County，Hainan Province in 2020

2.2 海南省白沙县新生儿地贫基因类型及检出率 本次针对地贫基因的筛查中，共检出试剂盒中包含的34种类型，其中α地贫基因型为最多，共检出521例；其次是α地贫复合β地贫基因型，共检出62例；β地贫基因型最少，共检出 25例。其中-α3.7/αα、-α4.2/αα 和 αWSα/αα 基因型排在所有检出基因型的前三位，分别占26.3%、23.8%和12.7%，并检出-α4.2/HKαα、c.118C>T和c.309C>T三种少见地贫基因型。详见表2～4。

表2 海南省白沙县新生儿α地贫基因型及检出率Table 2 Genetic types and detection rates of neonatal α thalassemia in Baisha County，Hainan Province

表3 海南省白沙县新生儿β地贫基因型及检出率Table 3 Gene types and detection rate of βthalassemia in newborn population of Baisha County，Hainan Province

表4 海南省白沙县新生儿α地贫复合β地贫基因型及检出率Table 4 Genetic types and detection rates of α thalassemia combined with β thalassemia in newborn population of Baisha County，Hainan Province

3 讨论

有研究数据表明，全世界每年有超过33万的新生儿血红蛋白异常，其中就有17%是地贫患儿[6]。而且地贫症状一般隐匿性强，患儿出生3～6个月才逐渐出现严重贫血的典型地贫症状，并常伴有发育迟缓、骨骼异常等症状，严重者甚至可能出现心力衰竭等并发症，重型患者如不尽早进行干预治疗，多于5岁前死亡[7]。海南省已见地贫相关的多篇成人文献[3-5]，但还未见针对新生儿群体的地贫报道。

2020 年白沙县内各助产单位活产新生儿932例，因部分家长拒绝参与筛检，实际收集到样本912例，筛查率达97.9%（912/932），因此受检人群能代表全体白沙县新生儿人群。本次筛查共检出608例地贫基因异常新生儿，海南省白沙县地贫基因携带率高达66.7%，分析原因可能与民族构成有关，本次筛查样本中黎族540例，而汉族仅为340例，黎族比例高，黎族地贫基因高携带率[9]已是不争事实，白沙县地处海南省中部山区，交通极为不便，外输人口少，推测民族之间通婚发生了基因融合，导致了该地区新生儿地贫基因的高携带率。目前国内尚未有文章报道如此高的地贫基因携带率。因此本研究抽取前81例样本采用凯普基因试剂盒验证，抽取中间35例样本使用亚能地贫基因试剂盒进行验证，结果与熔解曲线法检测的地贫结果完全一致。这证明海南省白沙县新生儿群体地贫基因携带率确实高，需要引起有关部门的注意，白沙县并非海南省唯一少数民族自治县，黎族地贫基因高携带率已被认知，大量的黎族同胞聚居昌江、乐东、琼中等七个少数民族市县的情况下，建议海南省政府应在白沙县等少数民族聚居地进行新生儿地贫基因筛查，以提高少数民族地区出生人口素质和生活质量、降低新生儿的死亡率。

本研究中白沙县黎族新生儿人群地贫基因携带率最高，达76.7%，高于汉族的51.5%和其他少数民族的59.4%，这验证了“黎族是地贫基因携带率高的民族”的结论[9]。

海南省白沙县地贫基因型丰富，本次共检出34种基因型，地贫基因型分类以α地贫基因型为主，这符合地贫在中国南方的分布特征[10-11]，而不同于重庆地区以β地贫基因型为主的状况[12]。白沙县α地贫基因型以-α3.7/αα、-α4.2/αα和αWSα/αα最常见，这与海南陵水县[13]具有相似之处，可能原因为陵水县和白沙县均属于黎族自治县，但因为黎族人口所占比例不同而略有区别。白沙县β地贫基因型以βCD41-D42/βN多见，这与四川地区[14]一致，而与贵州[15]有别，进一步验证了地贫基因分布存在地域特征[16-17]。在发现的3种少见基因型中有2例少见基因型c.309C>T，这是试剂盒未涵盖的位点，经熔解曲线图外送基因测序得到了证实，该突变是一种错义突变，目前还无文献报道。其余两种少见基因型已有报道[18]。

鉴于海南省是地贫的高发地区，海南省政府特别重视地贫防控，从2012年开始便将地贫纳入婚检项目，在婚检和孕检人群中开展地贫筛查，建立地贫防控工作与免费婚检工作相结合的新机制。虽然儿童地贫患病率有减低趋势[19]，但有报道称海南省海口市和三亚市新生儿人群中地贫发生率仍高达5%[20]和7.85%[19]，地贫患儿的营养和发育状况更差[21]，因此在婚检和孕检中进行地贫防控的前期，应该在新生儿人群进行地贫基因筛检，这将是对地贫防控网络的必要而有益补充。

对于新生儿群体来讲，传统的血常规、电泳及基因检测联合筛查地贫方式存在着诸多不利因素，因此借助新生儿疾病筛查滤纸干血斑进行地贫基因检测，不用重复采血，有利于群体性筛查，而且该方法也得到了临床验证[22-23]。

总之，海南省白沙县新生儿人群中地贫基因携带率高，以α 地贫基因型最为常见。本研究对白沙地区地贫筛检提供了参考，也为政府决策部门制定地贫防控策略提供了有力的数据支持。

本研究局限性：

（1）只统计了白沙县新生儿地贫基因的高携带率，但限于目前对于地贫的认知水平和随访中存在着家长配合度等各种困难，并未在此论述地贫基因型与表型的关系；在临床表型中，轻型和静止型患者与常人无异，因此并未对此加以详述，但此研究证明了白沙县新生儿地贫的高携带率，这为政府决策部分地贫防控提供了方向；（2）本研究使用的基因试剂盒涵盖的位点虽然较多，未检出地贫样本也不一定未携带地贫基因，也可能为其他罕见型，这需要不断随访来证实；（3）地贫熔解曲线方法只是筛选核酸序列而不是氨基酸序列，但鉴于地贫的复杂性，仍有可能发生多态性或同义突变被判读为突变型的情况。

作者贡献：石海杰负责文章的构思与设计、文献检索与数据提取和统计分析、论文撰写；赵振东负责文章的构思与设计、研究实施、数据资料收集和分析、论文的修订和审校，对文章整体负责。

本文无利益冲突。