微小RNA-1273g-3p 对人结直肠癌HCT116 和SW480 细胞增殖和迁移的影响#

李朝辉 刘大威 夏添明 孙生安 王云帅

（郑州大学附属洛阳市中心医院胃肠外科，河南 洛阳 471000）

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是胃肠道常见的恶性肿瘤之一，随着生活方式的改变和环境等因素的影响，其发病率有逐年上升趋势。结直肠癌患者早期症状不典型，导致多数患者确诊时已是肿瘤晚期，造成治疗延误，病死率居高不下[1]。

微小RNA（MicroRNA，miR）是一种非编码单链核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA），数量不多，但参与多种基因水平的调控，在机体生长发育、细胞分化、增殖、凋亡及肿瘤发生发展中发挥着重要的作用[2-3]。研究表明miR-1273g-3p 在胰腺癌中高表达[4]，而本课题组既往研究显示，miR-1273g-3p 在结直肠癌患者血清中也呈高表达，但是否具有促癌基因的作用未做研究。因此本文以结直肠癌HCT116 和SW480 细胞株为研究对象，以miR-1273g-3p 模拟物转染结直肠癌细胞，检测miR-1273g-3p 对结直肠癌细胞增殖、迁移的影响，以探究miR-1273g-3p 对结直肠癌发生发展的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人结直肠癌细胞株HCT116 和SW480（卓越创新中心）；DMEM 培养基、胎牛血清（Sigma）；LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent、Opti-MEMTM（Ⅰnvitrogen）；Trizol 总RNA 提取试剂盒（天根）；miR-1273g-3p mimics 双链及其阴性对照（上海吉玛）；miR-1273g-3p 引物和U6 内参引物（天根）；聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）相关试剂、反转录（Reverse Transcription，RT）试剂盒（天根）；噻唑蓝（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂盒（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

以含10% FBS 的DMEM 在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养结直肠癌细胞HCT116 和SW480。

1.2.2 过表达miR-1273g-3p 瞬时转染

以100 nM Lip2000 将miR-1273g-3p 模拟物瞬时转染HCT116 和SW480 细胞，获得miR-1273g-3p 过表达的细胞。用未行转染处理的HCT116 和SW480 细胞分别做对照。在DMEM（含10% FBS）培养基、37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养48 h。

1.2.3 PCR 检测miR-1273g-3p 表达采用Trizol 法提取细胞总RNA，以紫外光分光光度计A260/A280 检测RNA 浓度。采用miRcute 增强型miRNA cDNA 第一链合成试剂盒，在42℃ 60 min（miRNA 加A 尾反应和逆转录反应），95℃ 3 min（酶失活反应）条件下进行逆转录获得cDNA。RT-PCR 采用miRcute 增强型miRNA 荧光定量检测试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司）。PCR 反应以U6 为内参，在95℃ 15 min 1 cycle，94℃ 20 s、60℃ 34 s 40 cycle 条件下反应。相应的引物见表1。实验结果采用2-ΔΔCt法分析。

表1 引物序列

1.2.4 MTT 法检测细胞生长

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，铺板于96 孔平底板使待测细胞密度在103-104/孔，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育，待细胞单层铺满板底，加入0.5%MTT 溶液20 μL，每孔设置3 复孔，同时设置调零孔和对照孔。继续孵育4 h 后，小心弃上清液，每孔加入DMSO 200 μL，低速震荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶标仪在 630 nm 波长处测量并记录每孔的光密度（Optical density，OD）值。

1.2.5 Transwell 检测细胞迁移能力

将细胞撤血清饥饿12-24 h 后消化并重悬细胞，细胞计数调整细胞密度5×105。取200 μL 细胞悬液加入transwell 上室，下室加入5%FBS 培养基，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24 h。取出小室，用棉签将上层小室内细胞轻轻擦拭干净，用4%IFA（多聚甲醛）将下室细胞固定30 min，PBS 漂洗2 次后用1%结晶紫染色20 min，水洗后于显微镜下拍照计数。

1.3 统计学方法

使用SPSS 25.0 统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差（±SD）表示，组间比较采用t检验，以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MiR-1273g-3p 经转染后在HCT116 和SW480细胞中的表达

聚合酶链反应检测miRNA-1273g-3p 表达显示，转染miRNA-1273g-3p 模拟物后，HCT116 和SW480 细胞中miRNA-1273g-3p 的相对表达量与对照组比较明显提高（P＜0.01），见图1；证明转染成功，外源性 miR-1273g-3p 在结直肠癌HCT116 和SW480 细胞中稳定表达。

图1 miRNA-1273g-3p 的相对表达量

2.2 过表达miR-1273g-3p 对HCT116 和SW480细胞增殖的影响

转染miR-1273g-3p 模拟物72h 后，过表达组中HCT116 和SW480 细胞增殖比例明显高于对照组（P<0.01），见图2。

图2 过表达miR-1273g-3p 对HCT116 和SW480 细胞增殖的影响

2.3 过表达miR-1273g-3p 对HCT116 和SW480细胞迁移的影响

转染miR-1273g-3p 模拟物72 h 后，过表达组中HCT116 和SW480 细胞数明显高于对照组（P<0.01），表3 和图3。

图3 过表达miR-1273g-3p 对HCT116 和SW480 细胞迁移的影响

表3 过表达miR-1273g-3p 对HCT116 和SW480 细胞迁移的影响（±SD，n=3）

表3 过表达miR-1273g-3p 对HCT116 和SW480 细胞迁移的影响（±SD，n=3）

注：与对照组相比，**P＜0.01。

组别 细胞数量HCT116 SW480未转染组 445.00±20.298 404.00±19.519转染组 843.67±23.007** 827.67±27.006**

3 讨论

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，近十年来结直肠癌的发病率逐渐上升[5]。开展结直肠癌相关分子机制研究，寻找新的治疗靶点、分子标志物等，对改善结直肠癌患者的生存预后具有极其重要的临床意义和社会价值。

目前研究表明，miRNA 异常表达在肿瘤的发生和转移中具有重要作用，有望成为肿瘤治疗的新方向[6-8]。

在卵巢癌中，miR-1273g-3p 可以调节肿瘤坏死因子-a（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、α1-Ⅰ型胶原基因（Type α1-Ⅰ collagen gene，COL1A1）、基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase 2，MMP-2 ）、 基 质 金 属 蛋 白 酶-9 （ Matrix metalloproteinase 9，MMP-9）等基因的表达水平，同时可作为化疗后复发性上皮性卵巢癌诊断的预后生物学标志物[9]。

长链非编码RNA （Long non-coding RNA，LncRNA）RP11-279C4.1 通过调节miR-1273g-3p/色素框同源物3（Chromobox homolog 3，CBX3）轴来增强胶质瘤细胞的恶性行为[10]。而miR-1273g-3p 对结直肠癌细胞功能的影响及机制目前尚不清楚。

本研究首先通过RT-PCR 发现miR-1273g-3p在HCT116 细胞和SW480 细胞中高表达；接着通过miR-1273g-3p模拟物转染使HCT116和SW480细胞过表达miR-1273g-3p 发现，miR-1273g-3p 能促进HCT116 细胞和SW480 细胞的增殖和迁移。这说明miR-1273g-3p 在结直肠癌中可能起着促癌作用。但我们的研究没有检测miR-1273g-3p 水平下调对结直肠癌细胞的增殖和迁移能力的影响。且 miR-1273g-3p 对结直肠癌细胞 HCT116、SW480 细胞功能的影响的具体分子机制目前尚不明确，这是后续进一步研究的方向。本研究的对象是结直肠癌细胞，进一步可以研究miR-1273g-3p 表达情况与结直肠癌临床病理特征的关系，进一步探究miR-1273g-3p 在结直肠癌中的作用。

总之，本研究结果显示miR-1273g-3p 可能具有促进结直肠癌细胞HCT116、SW480 的增殖和迁移能力，从而在结直肠癌细胞中起促癌因子的作用。为进一步研究miR-1273g-3p 在结直肠癌中的作用机制提供了一定基础。