大豆疫霉病病菌生防放线菌的筛选、鉴定及生防效果

纠敏 李晶晶 李伟山 冯辉 刘瑞显 魏利辉 周冬梅

摘要：   為了开发对大豆疫霉病病菌具有拮抗作用的放线菌资源，从健康大豆根际土壤中分离筛选获得2株对大豆疫病具有显著抑制效果的生防放线菌菌株JAX-13和JAX-14。经生理生化和分子生物学鉴定，菌株JAX-13和JAX-14分别为放线菌属细菌（ Actinomycetales bacterium ）和链霉菌（ Streptomyces ）。平板拮抗试验结果表明，2种菌株对大豆疫霉病病菌的抑制率分别为56.26%和50.06%;光学显微镜观察发现，菌株JAX-13和JAX-14发酵液处理的大豆疫霉病病菌菌丝排列杂乱无章，菌丝生长受到抑制并且菌丝内部出现原生质聚集成块现象。盆栽试验结果表明，经菌株JAX-13和JAX-14发酵液处理的大豆对大豆疫霉病病菌的防效分别达56.56%和72.22%，且菌株发酵液对大豆植株具有一定的促生作用。总体来看，菌株JAX-13和JAX-14生防效果优良，是2种具有潜在应用价值的放线菌。

关键词：  放线菌; 链霉菌; 生物防治; 大豆疫病; 大豆疫霉病病菌

中图分类号：  S482.2 +92    文献标识码： A    文章编号：  1000-4440（2021）05-1137-06

Screening， identification and biocontrol effect of actinomycetes against  Phytophthora sojae

JIU Min  1 ， LI Jing-jing  1，2 ， LI Wei-shan  1，2 ， FENG Hui  2 ， LIU Rui-xian  3 ， WEI Li-hui  2 ， ZHOU Dong-mei  2

（1.College of Food and Bioengineering， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023， China; 2.Institute of Plant Protection， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China; 3.Institute of Industrial Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：  To develop actinomycete resources with antagonistic effect on  Phytophthora sojae ， two strains of biocontrol actinomycetes JAX-13 and JAX-14 were isolated and screened from healthy soybean rhizosphere soil， which had significant inhibitory effect on soybean  Phytophthora  blight. Through physiological， biochemical analysis and molecular biology identification， strains JAX-13 and JAX-14 were identified as  Actinomycetales bacterium  and  Streptomyces ， respectively. The results of plate confrontation test showed that， the inhibition rates of two strains to  P. sojae  were 56.26% and 50.06%， respectively. Through optical microscope observation， it was found that the hyphae of  P. sojae  treated by the fermentation broth of JAX-13 and JAX-14 strains arranged disorderly， the growth of hyphae was inhibited and the protoplasm in hyphae gathered into lumps. The results of pot experiment showed that， after treated with fermentation broth of JAX-13 or JAX-14 strain， the control effects of soybeans against  P. sojae  were 56.56% and 72.22%， respectively， and the fermentation broth showed some promoting effects on the growth of soybean plants. In general， strains JAX-13 and JAX-14 are two kinds of actinomycete with good biocontrol effect and show potential application value.

Key words：  actinomycete;  Streptomyces ; biological control; soybean blight;  Phytophthora sojae

大豆疫病是由大豆疫霉菌（ Phytophthora sojae ）感染引起的一种分布范围广、危害极其严重的全球性土传病害，防治十分困难  [1-2] 。大豆疫霉病病菌在大豆的整个生育期内都可以进行侵染，造成种子、根、茎等腐烂，植株枯死，大豆产量严重损失  [3] 。大豆疫病防治的最有效方法是选育抗病品种，但是其抗病资源极为有限  [4] 。目前，预防和控制疫病主要依赖化学防治方法，但化学防治方法的长期使用会造成农药残留、环境污染、危害人类及动物健康等问题  [5] 。生物防治方法利用微生物资源来防治植物病害，具有绿色、安全、无污染等特点，是一种具有发展潜力的防治方法  [6] 。因此，开发具有防病抗病、绿色无污染的生物防治方法是一种大豆疫病防控的良好途径。

放线菌属于一类能够产生多种活性代谢产物且分布广泛的细菌类微生物。目前，研究人员开发出来的抗生素种类中70%以上均由放线菌产生  [7-8] 。链霉菌是一种在土壤中含量较多的放线菌，能够在土壤中产生多种具有生物活性的次生代谢产物，具有促生和抗病等多种功能  [9-10] ，具有潜在的研究和应用价值。刘婷婷等  [11] 从白山市的人参根围筛选到1株对多种病原真菌都具有较强抑菌作用的放线菌TL-007，并鉴定出其为黑胡桃链霉菌（ Streptomyces nogalater ），该菌株对锈腐病的抑菌率为85.93%，在农业生产上具有应用价值。林睿等  [12] 从内蒙古土壤样品中分离到2株链霉菌属（ Streptomyces  sp.）放线菌WH4-57和WH4-58，其对大肠杆菌（ Escherichia coli ）、酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae ）等都具有较强的广谱抗性。黄军等  [13] 从多年连作的健康辣椒植株根中分离到1株鲤链霉菌（ S. carpaticus ）PES-A23，其对辣椒疫霉病病菌（ Phytophthora capsici ）、辣椒镰刀枯萎病病菌（ Fusarium  spp.）、辣椒炭疽病病菌（ Colletotrichum  spp.）、辣椒金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus ）等均具有显著的抑制效果。

目前，已有芽孢桿菌（ Bacillus ）和假单胞菌（ Pseudomonas ）用于防治大豆疫病的广泛报道  [14-18] ，但关于放线菌防治大豆疫病的相关报道较少  [19-21] 。为进一步开发对大豆疫霉病病菌具有拮抗作用的放线菌资源，本研究从江苏省大豆田未发病大豆根际土壤中分离得到对大豆疫霉病病菌具有抑制作用的放线菌JAX-13和放线菌JAX-14。本研究发现的生防放线菌为大豆疫病的控制提供有效资源，并为下一步分离其中的有效成分提供基础，对利用放线菌开展大豆疫病的生物防治具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

土壤样品采自江苏省宿迁市未发病的大豆根际土壤。供试病原菌菌株为大豆疫霉病病菌，由南京农业大学王源超实验室提供。

放线菌的筛选和抑菌活性测定参照牛红杰  [22] 的方法进行，培养基分别为高氏一号培养基和马铃薯琼脂（PDA）培养基。放线菌的蛋白酶活性和几丁质酶活性测定参照徐刘平  [23] 的方法进行，培养基分别为蛋白质培养基和以胶体状几丁质为唯一碳源的培养基（Chi-Ayers）。放线菌的纤维素酶活性测定参照Ghose  [24] 的方法进行，培养基为纤维素酶活性测定培养基。嗜铁素的产生参照Shin  [25] 等的方法进行测定，培养基为嗜铁素检测培养基（CAS）。

供试大豆种子：合丰35号。

1.2 试验方法

1.2.1 放线菌的分离纯化  将采集的3 g新鲜土壤样品添加到含27 ml无菌水的玻璃三角瓶中，150  r/min 振荡培养30 min。从三角瓶中取1 ml土壤悬浮液加入到含9 ml无菌水的试管中，混匀后，利用梯度稀释法制成10  -1 、10  -2 、10  -3 、10  -4 、10  -5 、10  -6 的土壤稀释液。用玻璃涂布棒在高氏一号培养基上均匀涂100 μl上述各浓度的稀释液，每个浓度设3个重复，28 ℃连续培养3 d。选取菌落总数在 50～ 300 CFU的平板，计数并依次挑取长出的菌落，在高氏一号固体培养基上纯化后，用接种环挑取单一菌落接种于盛有5 ml高氏一号液体培养基的试管中，28 ℃、200  r/min 振荡培养 24～ 28 h，取悬浮液与等体积50%甘油溶液混匀，于 -80 ℃ 保存备用。

1.2.2 抗性放线菌的筛选与鉴定  平板对峙试验：用打孔器从大豆疫霉病病菌平皿中打取大小为 6 mm× 6 mm的大豆疫霉病病菌琼脂块，倒置于PDA平板上，同时用接种环分别挑取待测菌，在距中心2 cm的边缘划线，并设置空白对照。28 ℃培养 5～ 7 d后，观察是否有抑菌现象。挑选抑菌效果显著的菌株进行保存，用于后续研究。分子鉴定：按照细菌基因组DNA提取试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司产品]说明书提取放线菌基因组DNA。16 S rDNA的PCR扩增使用通用引物：27 F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和149 R（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGACA-3′）。25.0 μl PCR反应体系：dNTP Mix（10  mmol/L ）0.5 μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶0.5 μl，27 F 1.0 μl，149 R 1.0 μl，灭菌蒸馏水21.0 μl，提取的总DNA 1.0 μl。PCR反应程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min，57 ℃ 55 s，72 ℃ 2 min，30个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物电泳后测序，将测序结果用NCBI的BLAST进行同源性检索，从而鉴定菌株。

1.2.3 是否具有蛋白酶活性的测定  用接种针挑取生防菌接种在蛋白质培养基上，25 ℃下培养3 d后观察，如果菌落周围有透明圈，则表示有蛋白酶活性，否则表示没有蛋白酶活性。

1.2.4 能否产生嗜铁素的测定  用消毒灭菌针或牙签挑取放线菌接种在CAS培养基中，25 ℃连续培养3 d，若放线菌菌落周围出现橘黄色的小晕圈，则表明放线菌菌株具有产生嗜铁素的能力，否则表示不具有产生嗜铁素的能力。

1.2.5 能否产生纤维素酶的测定  用消毒灭菌针或牙签挑取放线菌，接种在纤维素酶活性测定培养基中，25 ℃下培养3 d后将其取出，用刚果红（ 1 000   mg/L ）加水染色1 h后，用氯化钠（1  mol/L ）加水浸泡1 h，若放线菌菌落周围产生透明圈，则表明放线菌菌株具有产生纤维素酶的能力，否则表示不能直接产生纤维素酶。

1.2.6 能否产生几丁质酶的测定  用消毒灭菌针或牙签挑取放线菌菌落，接种在Chi-Ayers培养基中，25 ℃下培养5 d后，若放线菌菌落周围有透明圈，则表明放线菌菌株能产生几丁质酶，否则表示放线菌菌株不能产生几丁质酶。

1.2.7 放线菌的液体培养  在100 ml高氏一号液体培养基中接种100 μl放线菌菌液，28 ℃下连续培养5 d后，取20 ml菌液接种到含300 ml高氏一号液体培养基的玻璃三角瓶中，28 ℃、180  r/min 连续培养7 d后， 8 000   r/min 离心20 min，收集发酵液，4 ℃保存备用。

1.2.8 放线菌发酵液对大豆疫霉病病菌的抑制效果  将放线菌上清液和PDA培养基以 1∶ 5（体积比）混合制成培养基。将大豆疫霉病病菌菌碟菌丝朝下接种在平板（大小为 6 mm× 6 mm）中央，于25 ℃培养6 d后测量菌落半径（对照组测量大豆疫霉病病菌的菌落半径，处理组测量靠近生防菌的大豆疫霉病病菌的菌落半径），以加无菌水处理的PDA平板作为对照，计算抑菌率  [26] ，计算公式：抑菌率=（对照组菌落半径-处理组菌落半径）/对照组菌落半 径× 100%。

1.2.9 放线菌发酵液对大豆疫霉病病菌菌丝的影响  为了准确检测放线菌在体外对大豆疫霉病病菌菌丝的拮抗作用，分别取5 ml JAX-13和JAX-14發酵液，4 ℃、 10 000   r/min  离心10 min，然后用0.22 μm细菌过滤器过滤发酵液，获得无菌放线菌发酵液。用显微镜（型号：LEIGC DM2500）观察JAX-13、JAX-14发酵液对大豆疫霉病病菌菌丝的影响，以灭菌水作为对照，每组3次重复，观察并拍照记录。

1.2.10 放线菌发酵液对大豆疫霉病病菌拮抗作用的离体试验  分别将大豆叶片完全浸在JAX-13、JAX-14的发酵液或无菌水中1 min，然后从生长5 d的大豆疫霉病病菌菌落边缘挑取1个菌碟接种于经处理的叶片中心。接种48 h后，用75%乙醇对叶片进行脱色处理后，统计病斑直径，定量评价2种放线菌对大豆疫霉病病菌的拮抗作用。每组处理6张叶片，重复3次。

1.2.11 放线菌发酵液防治大豆疫霉病病菌的温室试验  大豆生长14 d后，取长势一致的植株，每株大豆根围接种2 ml放线菌发酵液（对照组接种2 ml灭菌水）。接种放线菌发酵液7 d后，采用下胚轴接种法  [27] 接种大豆疫霉病病菌，即在大豆植株的下胚轴1 cm处用手术刀划取伤口后接种大豆疫霉病病菌菌饼（直 径 为6 mm），将处理后的大豆植株放在25 ℃、湿度80%和16 h光照/8 h黑暗的条件下培养4 d，统计发病情况。每个处理18株大豆植株，重复3次。

1.3 数据处理

数据处理和分析使用Microsoft Excel 2010软件。

2 结果与分析

2.1 生防放线菌对大豆疫霉病病菌的拮抗作用与菌种鉴定

从大豆根际土壤中共获得14株放线菌菌株。将测序结果在NCBI网站上进行BLAST比对后发现，主要为放线菌属细菌（ Actinomycetales bacterium ）、链霉菌（ Streptomyce  sp.）和疮痂链霉菌（ Streptomyces scabiei ）（表1）。平板拮抗试验结果表明，对大豆疫霉病病菌有抑制作用的放线菌共有11株，其中JAX-13（ Actinomycetales bacterium ）和JAX-14（ Streptomyce  sp.）对大豆疫霉病病菌具有显著的抑制效果（图1），抑菌率分别为56.26%和50.06%。

2.2 生防菌JAX-13和JAX-14的酶活性检测

由图2可知，菌株JAX-13可以分泌蛋白酶、嗜铁素、纤维素酶和几丁质酶，菌株JAX-14可以分泌纤维素酶、嗜铁素和蛋白酶，但不能分泌几丁质酶。

2.3 放线菌发酵液对大豆疫霉病病菌菌丝的影响

显微镜观察结果表明，对照组生长正常，菌丝光滑、均匀，菌丝末端分枝近似直角，菌丝体不发生弯曲。放线菌菌株JAX-13和JAX-14发酵液处理过的大豆疫霉菌菌丝杂乱无章，菌丝的部分位置弯曲变粗，分枝的角度发生改变，分枝数量减少，且菌丝内部原生质集中成块（图3）。

2.4 放线菌发酵液对大豆疫霉病病菌的离体防效

菌株JAX-13和JAX-14发酵液对大豆叶片中大豆疫霉病病菌的拮抗作用研究结果表明，在接种2 d后，相比经H  2 O处理过的对照组（CK），大豆疫霉病病菌能轻微侵染JAX-13和JAX-14发酵液处理的叶片，但病斑直径较小（图4）。其中经JAX-13发酵液处理过的病斑直径为1.30 cm，经JAX-14发酵液处理过的病斑直径为1.60 cm，对照组病斑直径为2.00 cm（图5）。

2.5 放线菌发酵液对盆栽大豆疫霉病的防效

经放线菌菌株JAX-13和JAX-14发酵液处理后的植株部分出现倒伏，没有出现死亡植株;而对照组大豆植株全部倒伏，甚至枯萎死亡（图6），表明放线菌能抵抗大豆疫霉病病菌的侵染。防病率和防效的统计结果表明，经菌株JAX-13处理后的大豆发病率为44.44%，防效可达56.56%;经菌株JAX-14处理后的大豆发病率为27.78%，防效可达72.22%。相比对照组有显著差异，防治效果明显。

3 讨 论

本研究分离到2株对大豆疫霉病病菌均具有抑制效果的放线菌菌株JAX-13和JAX-14，经鉴定JAX-13和JAX-14分别为放线菌属细菌和链霉菌。

链霉菌主要通过拮抗性、竞争性、重寄生性、诱因性和耐受性作用机制来防治各种动植物病害，且链霉菌不仅仅通过一种作用发挥其生防功能，通常是由多种作用共同发挥其生防功能  [28] 。研究结果表明，链霉菌产生的活性物质能够抑制病原菌的生长  [29] 。杨红旗  [30] 从菜豆中发现的几丁质酶能够抑制真菌生长，而且水稻、烟草、马铃薯、大麦、玉米产生的几丁质酶也能有效抑制多种病原菌的生长  [31-32] 。本研究发现，菌株JAX-13和JAX-14均能产生蛋白酶、嗜铁素、纤维素酶，其中JAX-13还可以产生几丁质酶。推测菌株JAX-13和JAX-14的抑菌机制可能是通过溶菌作用或竞争作用来抑制大豆疫霉菌生长，具体如何发挥作用还需进一步探究。

黄敏敏  [33] 从福建的土壤样品中分离到1株生防放线菌Z-16，可使大豆疫霉菌菌丝出现大量分枝、歪曲、变粗变短，孢子及菌丝出现不同程度的紧缩、干瘪，一些孢子还出现不正常破裂、孢子内含物外泄等。本研究还发现，菌株JAX-13和JAX-14的发酵液对大豆疫霉病病菌菌丝生长具有明显的影响，通过显微镜观察，对照组菌丝纤细光滑，生长正常，而经菌株JAX-13和JAX-14发酵液处理的大豆疫霉病病菌菌丝排列杂乱无章，分枝减少，且菌丝内部原生质聚集成块。由此可见，菌株JAX-13和JAX-14发酵液可以较好地抑制大豆疫霉病病菌菌丝的生长。

链霉菌可产生多种抗菌物质，对病原菌细胞壁、蛋白质和核酸的合成等具有抑制作用  [34-38] 。在叶片离体试验中，菌株JAX-13和JAX-14的发酵液对大豆疫霉病病菌有显著防效。在盆栽试验中，用菌株JAX-13和JAX-14的发酵液处理后的大豆发病率均有明显降低，防治效果明显，菌株JAX-14的防效更为显著。由于菌株JAX-13和JAX-14的发酵液通过细菌过滤器过滤除去了其中的活菌，说明菌株的防治作用不一定来自菌种之间活菌的相互竞争，可能与发酵液中的一些化学产物相关，具体机制有待进一步研究。

此外，菌株JAX-13和JAX-14还可能通过诱导植物抗性从而防治大豆疫病。金娜等  [39] 研究发现，链霉菌HDZ-9-47发酵液处理感染红灰链霉菌的番茄后，能有效提高番茄表皮中多酚氧化酶、过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶的活性，进而提高番茄抗性。因此，菌株JAX-13和JAX-14的生防机制可能通过多种作用相互结合进而具有稳定的效果，这种生防菌机制能够在各种复杂多变的条件和环境中较好地抑制疫霉病病菌的繁殖和生长。本研究后续将对菌株JAX-13和JAX-14产生的活性物质进行分离、纯化和鉴定，对其是否引起植物诱导抗性进行验证，对其在田间的应用进行评估，以期更好地开发其生防功能，为大豆疫病的防治提供新的方法。

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（责任编辑：陈海霞）