北极海洋沉积物中放线菌多样性及抑菌活性筛选

常显波+柳瑞翠+刘文正+张晓华

摘要：采用平板涂布法利用6种培养基从北极海洋沉积物中共分离出109株放线菌。选取34株代表菌株进行16S rDNA测序分析。结果表明，它们分属于链霉菌属（Streptomyces）、假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）和拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis），其中Streptomyces为优势菌属；不同采样点获得放线菌的种类和数量有较大不同，站位点P37分离到的放线菌数量和种类最多；在109株放线菌中，有39株对病原菌有抑菌活性，其中有21株、11株和17株放线菌分别对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长有抑制作用。

关键词：北极；海洋沉积物；放线菌；多样性；抑菌活性

中图分类号：Q939.99 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）13-3014-05

Diversity and Antibacterial Activity Screening of Actinomycetes in the Marine Sediments of North Pole

CHANG Xian-bo1，LIU Rui-cui1，LIU Wen-zheng2，ZHANG Xiao-Hua2

（1.College of Environmental & Material Engineering， Yantai University， Yantai 264005，Shangdong， China；

2. College of Marine Life Sciences， Ocean University of China， Qingdao 266003， Shangdong， China.）

Abstracts： Diversity and actinobacterial diversity in the sediments of North Pole was investigated by selective isolation method. 109 actinomycetes were isolated using six different culture media（M1-M6）. Bioinformatics analysis of the 16S rDNA sequences assigned the 34 representative isolates to three genera （Streptomyces， Pseudonocardia and Nocardiopsis）， and Streptomyces was the dominant genus. The type of culture medium exhibited significantly the number and diversity of actinomycetes recovered. Out of 109 isolates， 39 isolates exhibited antimicrobial activity against human pathogens. The proportion of actinomycetes with antibacterial activity was highest from the culture medium M5.

Key words： North Pole； sea sediments； actinomycetes； diversity； antimicrobial activities

自从Ekelof 1908年首次报道从南极分离出微生物后，各国的微生物学家相继在极地进行过大量的研究工作，证明了微生物是极地生态系统的重要组成部分，特别是在极地的海水、海冰、海底沉积物中存在着各种类型的微生物[1]。由于极地所处的地理位置比较特殊，从而形成了一个寒冷、干燥、强辐射的环境条件，生存于其中的微生物必须具备相应独特的分子生物学机制和生理生化特征去适应这样的极端环境，特别是对于能够产生多种次级代谢产物的放线菌来说，极地应该是产生新型生物活性物质的放线菌菌株的重要生存繁衍之地[2，3]。对极地海洋沉积物中的放线菌进行分离培养、鉴定、抗菌活性等方面的研究，有利于进一步了解、开发和利用该地区放线菌资源。

为此，对来自北极的10份海洋沉积物样品进行放线菌的分离培养，通过16S rDNA序列测定，对分离出的菌株进行分子鉴定和系统发育分析，再对放线菌株进行抗菌活性筛选，希望能为今后极地海洋放线菌资源的研究和开发利用提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器 PCR 引物、PCR 常规操作用试剂和酶均购自TaKaRa公司。高压灭菌锅为上海产LS-B50L、高速冷冻离心机为Eppendorf 公司5817R型、PCR仪为Eppendorf AG 22331 Hamburg；凝胶成像系统GK-330C购自美国伯乐公司。

1.1.2 样品 10份极地海洋沉积物样品来自中国第三次北极科学考察，由中国极地研究中心提供，采样点概况见表1。

1.1.3 培养基 ①分离培养基：培养基M1（可溶性淀粉10 g，干酪素 0.3 g，KNO3 2 g，K2HPO4 2 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂 20 g，陈海水1 L，pH 7.2～7.4）、培养基M2（酵母浸出粉 4 g，麦芽浸出粉 10 g，葡萄糖 4 g，琼脂 20 g，陈海水1 L，pH 7.2～7.4）、培养基M3（葡萄糖 10 g，天门冬氨酸 0.5 g，K2HPO4 0.5 g ，MgSO4·7H2O 0.05 g，琼脂 20 g，陈海水1L，pH 7.2～7.4）、培养基M4（棉子糖 10 g，L-组氨酸 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂 20 g，陈海水1 L，pH 7.2～7.4 ）、培养基M5（天门冬氨酸 0.1 g，蛋白胨2 g，丙酸钠4 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂 20 g，陈海水1 L，pH 7.2～7.4）和培养基M6（甘油 6 mL，精氨酸 1 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂 20 g，陈海水1 L，pH 7.2～7.4）。所有分离培养基中均添加终浓度为25 μg/mL的萘啶酸以抑制快速生长的细菌，尤其是革兰氏阴性细菌；同时添加终浓度为100 μg/mL的制霉菌素溶液以抑制真菌的生长。②抑菌活性试验培养基：培养基M2和LB培养基（酵母膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0）。

1.1.4 病原菌菌株 以金黄色葡萄珠菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）为指示菌，菌株由中国海洋大学海洋生命学院海洋微生物实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离方法 采用传统的平板涂布法对样品进行分离，在28 ℃培养7～15 d。根据菌落大小、形态、颜色进行初步分离筛选并纯化，将纯化后的菌株接种到M2斜面上，培养3～4 d后，以5 mL灭菌保种液（0.85%NaCl溶液+15%甘油）洗下菌苔，制成菌悬液，每个菌种保存3管，-80 ℃保存。

1.2.2 菌株的抑菌活性检测方法 采用牛津杯法检测。

1）用竹签将供试放线菌株接种到M2液体培养基试管中，于28 ℃摇床以150 r/min培养2～3 d；菌液于12 000 r/min下离心10 min，取上清液进行试验。

2）将金黄色葡萄珠菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和迟缓爱德华氏菌接种于LB培养基，迟缓爱德华氏菌置于28 ℃、150 r/min的摇床中振荡培养，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌则置于37 ℃、150 r/min的摇床中振荡培养8～10 h后即可。

3）取各种病原菌100 μL分别涂布于各自的培养基平板上，再在平板上等距离放置6～8个无菌的牛津杯，吸取120 μL发酵上清液加入牛津杯中。移至37 ℃培养箱培养18～24 h后，观察牛津杯周围是否形成抑菌圈。

1.3 系统发育特征分析

16S rDNA PCR扩增和系统进化分析：参照文献[4]的方法提取放线菌基因组DNA，应用细菌16S rDNA通用引物（正向引物：8-27 F，反向引物：1429-1445R）进行PCR 扩增。测序所得结果用Blast软件在GenBank/EMBL/DDBJ 等数据库中进行相似性搜索，选取同源性比较高的典型菌株的16S rDNA 序列作为参比对象，用Clustal-X[5]软件进行多重序列比对，利用MEGA-4[6]软件，采用邻接法（Neighbor-Joining Method）进行聚类分析和系统进化树构建。

2 结果与分析

2.1 放线菌菌株的分离

从10份极地样品中共分离出109株放线菌，菌株编号为CXB503、CXB513、CXB516、CXB521～CXB523、CXB525～CXB531、CXB533、CXB535～CXB552、CXB554～CXB575、CXB579～CXB589、CXB592～CXB601、CXB603～CXB635、CXB636、CXB639、CXB640。从图1可知，各个站位点放线菌分离情况有较大差别。从采样点P37分离到的放线菌菌株无论是在数量还是种类上都是最多的，共分离到3个属的43株放线菌，放线菌分离率为39.4%，其次是站位点B12、S14、B-85-B和S24，而从P23样品中分离到放线菌的数量和种类最少，只分离到1个属的2株放线菌，放线菌分离率只有1.8%。

2.2 放线菌的16S rDNA序列分析

根据放线菌的特殊形态特征和颜色差异，选取34株代表菌株提取DNA及进行16S rDNA的扩增，并进行测序分析，将测序结果提交到GenBank数据库，获得序列号（JF512540～JF512561）。由图2可知，从北极沉积物样品中共分离出3个属的放线菌：Streptomyces（31株）、Pseudonocardia（1株）和Nocardiopsis（2株），其中优势菌属为Streptomyces；北极海区沉积物中可培养Streptomyces各类群多样性较高，在Streptomyces内不同种之间形成分支，其中与Streptomyces violascens同源性较高的菌株有10株，与已知菌种序列相似度在99.4%～100%，Streptomyces violascens为Streptomyces中的优势类群；与Streptomyces hydrogenans和Streptomyces somaliensis同源性较高的菌株分别有6株和5株，与已知菌种序列相似度均在99.6%以上；与Streptomyces hiroshimensis、Streptomyces rubiginosohelvolus和Streptomyces griseoplanus同源性较高的菌株各有2株，与已知菌种序列相似度在99.8%～100%；另外有2株菌分别属于Streptomyces rutgersensis和Streptomyces albidoflavus，与已知菌种序列相似度均在99.9%以上。各站位点放线菌多样性存在差异，Streptomyces在各站位点均有分布；2株Nocardiopsis菌株分离自站位点B12和P37，1株Pseudonocardia菌株分离站位点S14。

2.3 抑菌活性筛选结果

抑菌试验结果（表2）表明，在109株放线菌中，有39株对病原菌表现出抑菌活性，具有抑菌活性的菌株比例为35.8%；对革兰氏阳性病原菌具有较好的抑制效果，对革兰氏阴性病原菌的活性较弱；其中21株菌能抑制枯草芽孢杆菌生长、11株菌能抑制大肠杆菌生长、17株菌能抑制金黄色葡萄球菌生长、没有菌株能抑制迟缓爱德华氏菌生长；能同时抑制3种病原菌生长的放线菌有4株，分别为CXB526、CXB623、CXB626和CXB627；菌株CXB632对大肠杆菌的抑菌圈直径高达24 mm，但对其他病原指示菌无活性。不同站位点海洋沉积物中具有生物活性潜力的放线菌比例不同，站位点B85-B、B12和R15获得具有抑菌活性的放线菌比例较高，均≥50%，其中站位点B85-B分离到的11株放线菌都具有抑菌活性；其余站位点分离到具有抑菌活性的放线菌比例较低，其中站位点No.1和P23没有分离出具有抑菌活性的放线菌。

3 讨论

从北极海区不同采样点中分离到的放线菌种类和数量有较大差异，站位点P37分离到的放线菌种类和数量最多，与其他9个采样点相比较，样品采样深度和质地是最主要的区别，有意思的是，站位点No.1和P37质地均为粉沙黏土，但采样深度不同，分离效果却有较大差异。Bredholdt等[7]曾对北极Trondheim海湾不同深度的沉积泥样进行放线菌分离，发现在同一区域相同深度不同采样点的两份样品放线菌分离情况有很大差异，分析原因为两份样品的土质不同，一份为泥样，一份含有细沙。滕海波等[8]对8份不同海区海洋沉积样品进行放线菌分离，发现来自南极中山站地区潮间带样品ZS3中分离到的放线菌种类和数量最多，而从北极新奥尔松地区采集的沉积样品KS6中分离到的放线菌最少。可见，不同采样点样品间的放线菌多样性和数量都会有很大不同，这与样品所处的深度、温度、营养、盐度、样品质地等各因素有关。

不同海域放线菌的种群组成各不相同，研究发现大部分放线菌种类表现出地域差异性。Solano等[9]从北太平洋和哥斯达黎加的加勒比海岸沉积物中分离培养了137株放线菌，分别属于15个科21个属，其中Streptomyces是主要菌属。Pathom-Aree等[10]对马里亚纳海沟中的深海（10 898 m）沉积物的放线菌多样性进行研究，研究中发现了38株海洋放线菌，分别属于6个属（Dermacoccus、Kocuria、Micromonospora、Streptomyces、Tsukamurella和Williamsia），另外还首次在海洋环境中发现了原来只在陆生环境中发现的Dermacoccus和Tsukamurella的菌种。此次试验从北极海区沉积物中分离到3个菌属（Streptomyces、Pseudonocardia和Nocardiopsis）的放线菌，其中优势菌属为Streptomyces，这与其他研究者的研究结果有很大不同，如Yu等[11]在对北极加拿大海盆沉积物放线菌的分离研究中，未分离到Streptomyces的菌株，分离菌株主要为红球菌属（Rhodococcus）、迪茨氏菌属（Dietzia）、两面神菌属（Janibacter）、肿大地杆菌属（Terrabacter）、玫瑰考克氏菌属（Kocuria）和节杆菌属（Arthrobacter）；滕海波[8]对两极地区海洋沉积物进行放线菌的分离培养，其中优势菌群为赖氏菌属（Leifsonia）和红球菌属（Rhodococcus），也未分离到Streptomyces属。造成这种差异的原因是多方面的，经过分析发现，培养温度可能是造成这种差异的主要原因，Yu等[11]和滕海波[8]分别在15 ℃和12 ℃下培养样品，而本研究是在28 C培养样品，低温培养可能抑制气生菌丝发达的放线菌生长，所以在样品中没有分离到Streptomyces，具体机制有待进一步研究。

一些研究者已经报道了从海洋环境中分离的放线菌对多种病原菌具有抗菌活性，如Bredholdt等[7]从挪威最大的峡湾——特隆赫姆峡湾的海底沉积物中分离出3 200株放线菌，并对所分离出的放线菌进行抗细菌和抗真菌的筛选，显示这些放线菌具有强大的抗生素生产潜力；Ramesh等[12]从孟加拉湾分离的208株放线菌，有111株有抑菌活性；Imada等[13]从大土湾分离的100株放线菌中，有59株有抑菌活性。在本研究中，不同站位点海洋沉积物中具有生物活性潜力的放线菌比例不同，站位点B85-B、B12和R15获得具有抑菌活性的放线菌比例较高，这也充分说明海洋沉积物中放线菌次生代谢产物的合成在一定程度上受其生长环境的影响和限制，沉积物的经纬度、深度、物质组成、稠度与其中生长的微生物的生理代谢途径密切相关。极地沉积物样品中有抑菌活性的放线菌都属于Streptomyces，进一步印证了Streptomyces仍然是海洋放线菌次生代谢产物的主要产生菌。本研究抗菌活性试验所选的4种指示菌均为致病菌，分离到的放线菌对其中3种致病菌表现出较好的抑菌活性，从抑菌谱以及活性强弱上看，菌株CXB623、CXB627和CXB632有进一步研究的价值，对以后寻找新的抗生素提供了资源。

参考文献：

[1] 方金瑞.海洋微生物：开发海洋药物的重要资源[J].中国海洋药物，1998，17（3）：53-56.

[2] 曾胤新，陈 波.90年代日本等国家极区微生物学研究及其指导思想[J].微生物学杂志，1999，19（4）：35-43.

[3] 陈吉刚，杨季芳.极地微生物的工业应用及其与天体生物学研究的联系[J].生命的化学，2008，28（1）：97-100.

[4] LEE Y K， KIM H W， LIU C L， et al. A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials[J]. J Microbiol Methods， 2003， 52： 245-250.

[5] CHUN J， LEE J H， JUNG Y， et al. EzTaxon： a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences[J]. Int J Syst Evol Microbiol， 2007， 57： 2259-2261.

[6] TAMURA K， DUDLEY J， NEI M， et al. MEGA4： Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA） software version 4.0[J]. Mol Biol Evol，2007，24：1596-1599.

[7] BREDHOLDT H， GALATENKO O A， ENGELHARDT K， et al. Rare actinomycete bacteria from the shallow water sediments of the Trondheim fjord， Norway： isolation， diversity and biological activity[J]. Environ Microbiol， 2007， 9： 2756-2764.

[8] 滕海波.极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选[D].山东青岛：中国海洋大学，2009.

[9] SOLANO G， ROJAS-JIMENEZ K， JASPARS M， et al. Study of the diversity of culturable actinomycetes in the North Pacific and Caribbean coasts of Costa Rica[J]. Antonie Van Leeuwenhoek ， 2009， 96：71-78.

[10] PATHOM-AREE W， STACH J E M， WARD A C， et al. Diversity of actinomycetes isolated from Challenger Deep sediment（10，898 m） from the Mariana Trench[J]. Extremophiles， 2006，10：181-189.

[11] YU Y，LI H R，ZENG Y X，et al. Isolation and phylogenetic assignation of actinomycetes in the marine sediments from the Arctic Ocean[J]. Acta Oceanologica Sinica， 2005， 24（6）： 135-142.

[12] RAMESH S， MATHIVANAN N. Screening of marine actinomycetes isolated from the Bay of Bengal， India for antimicrobial activity and industrial enzymes[J]. World J Microbiol Biotechnol， 2009， 25： 2103-2111.

[13] IMADA C， SIMIDU U. Isolation and characterization of an alpha amylase inhibitor producing actinomycete from marine environment[J].Nippon Suisan Gakkaishi，1988，54：1839-1845.

[7] BREDHOLDT H， GALATENKO O A， ENGELHARDT K， et al. Rare actinomycete bacteria from the shallow water sediments of the Trondheim fjord， Norway： isolation， diversity and biological activity[J]. Environ Microbiol， 2007， 9： 2756-2764.

[8] 滕海波.极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选[D].山东青岛：中国海洋大学，2009.

[9] SOLANO G， ROJAS-JIMENEZ K， JASPARS M， et al. Study of the diversity of culturable actinomycetes in the North Pacific and Caribbean coasts of Costa Rica[J]. Antonie Van Leeuwenhoek ， 2009， 96：71-78.

[10] PATHOM-AREE W， STACH J E M， WARD A C， et al. Diversity of actinomycetes isolated from Challenger Deep sediment（10，898 m） from the Mariana Trench[J]. Extremophiles， 2006，10：181-189.

[11] YU Y，LI H R，ZENG Y X，et al. Isolation and phylogenetic assignation of actinomycetes in the marine sediments from the Arctic Ocean[J]. Acta Oceanologica Sinica， 2005， 24（6）： 135-142.

[12] RAMESH S， MATHIVANAN N. Screening of marine actinomycetes isolated from the Bay of Bengal， India for antimicrobial activity and industrial enzymes[J]. World J Microbiol Biotechnol， 2009， 25： 2103-2111.

[13] IMADA C， SIMIDU U. Isolation and characterization of an alpha amylase inhibitor producing actinomycete from marine environment[J].Nippon Suisan Gakkaishi，1988，54：1839-1845.

[7] BREDHOLDT H， GALATENKO O A， ENGELHARDT K， et al. Rare actinomycete bacteria from the shallow water sediments of the Trondheim fjord， Norway： isolation， diversity and biological activity[J]. Environ Microbiol， 2007， 9： 2756-2764.

[8] 滕海波.极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选[D].山东青岛：中国海洋大学，2009.

[9] SOLANO G， ROJAS-JIMENEZ K， JASPARS M， et al. Study of the diversity of culturable actinomycetes in the North Pacific and Caribbean coasts of Costa Rica[J]. Antonie Van Leeuwenhoek ， 2009， 96：71-78.

[10] PATHOM-AREE W， STACH J E M， WARD A C， et al. Diversity of actinomycetes isolated from Challenger Deep sediment（10，898 m） from the Mariana Trench[J]. Extremophiles， 2006，10：181-189.

[11] YU Y，LI H R，ZENG Y X，et al. Isolation and phylogenetic assignation of actinomycetes in the marine sediments from the Arctic Ocean[J]. Acta Oceanologica Sinica， 2005， 24（6）： 135-142.

[12] RAMESH S， MATHIVANAN N. Screening of marine actinomycetes isolated from the Bay of Bengal， India for antimicrobial activity and industrial enzymes[J]. World J Microbiol Biotechnol， 2009， 25： 2103-2111.

[13] IMADA C， SIMIDU U. Isolation and characterization of an alpha amylase inhibitor producing actinomycete from marine environment[J].Nippon Suisan Gakkaishi，1988，54：1839-1845.