天天胶囊的安全性评价

石高峰，夏建伟，蒋翠花，张东建，殷志琦，张 健*

1 南京中医药大学 第三临床医学院，南京 210028；2 江苏省中医药研究院 转化医学实验室，南京 210028；3 中国药科大学 中药学院中药制剂系，南京210009

便秘是一种慢性、复杂的胃肠道疾病，主要症状是粪便较干结、粪便量减少、排便次数减少、排便较费力、排便时间延长等。便秘的反复发作严重影响患者的生活质量。目前治疗便秘的药物有刺激性泻药、容积性泻药、渗透性泻药和促动力泻药等；但长期使用往往会引起腹痛、腹泻、水电解质紊乱和耐药性等。因此，安全性较高，具有良好通便功能的药品、保健品受到便秘患者的青睐。

天天胶囊作为一种具有通便作用的功能性物品，主要由芦荟、南瓜、低聚木糖、茯苓和银耳组成。以往研究证明，该品通过促进肠液分泌和改善胃肠动力缓解了洛哌丁胺诱导的大鼠便秘症状[1]。然而据文献报道，长期、大剂量服用含有蒽醌成分的芦荟可能会造成结肠黑变[2]，降低胃肠道传输功能[3]，甚至导致肝肾毒性[4]或诱发肠癌[5]。由于芦荟这些潜在的毒副作用，使得含有芦荟产品的安全性常常受到质疑。

本实验分别灌胃天天胶囊和芦荟粉13 周和26周观察大鼠血液学变化、胃肠传输功能、结肠黑变情况和肝肾毒性，探究前者长期使用的安全性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

天天胶囊（批号：20180923），芦荟（批号：20180120）均为河北御芝林药业提供；羧甲基纤维素钠（上海阿拉丁生化科技公司）；硫酸钡（青岛东风化工公司）；异氟烷（北京吉安德尔科技公司）；MUC2酶联免疫试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技公司）。

Opera t90fpe X 线数字胃肠机（意大利GMM 公司）；SynergyH1 全波长多功能酶标仪（美国BioTek公司）；Allera64R 超速控温离心机（美国Beckman Coulter 公司）；Axio Observer 荧光倒置显微镜（德国Carl zeiss 公司）；BC-2800Vet 全自动动物血细胞分析仪（深圳迈瑞公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 药物的配制分别准确称量天天胶囊内容物和芦荟叶细粉，用0.3% CMC-Na 配制所需浓度的混悬液。称取硫酸钡粉末适量，用生理盐水配制15%的钡餐混悬液（现配现用）。上述药物均置4 ℃冰箱保存。

1.2.2 动物分组和给药SPF 级SD 大鼠100 只，雄性，160～180 g，5 周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。饲养于江苏省中医药研究院实验动物中心，饲养条件：12 h 光照、12 h 黑夜交替循环，温度为（24±2）℃，相对湿度（60±10）%，所有动物自由饮水和进食。动物实验方案经江苏省中医药研究院伦理委员会审核并批准,伦理审批号：AEWC-025。

适应性喂养一周，将大鼠分为13 周和26 周两个大组，每组50 只；每大组再按体重随机分为5 组，每组10 只，分别为空白组（Blank）：每天灌胃给予0.3% CMC-Na 溶液；芦荟低剂量组（ALD）与高剂量组（AHD）：每天分别灌胃给予27 mg·kg-1与108 mg·kg-1的芦荟粉混悬液；天天胶囊低剂量组（TCLD）与高剂量组（TCHD）：每天分别灌胃给予108 mg·kg-1与432 mg·kg-1的天天胶囊内容物粉末混悬液。给药体积为10 mL·kg-1，连续给药13 周和26 周。天天胶囊给药剂量分别是临床1 粒服药剂量的3 倍和12倍，芦荟的给药剂量则是天天胶囊剂量的25%。

每日观察并记录大鼠的进食量、日常活动情况、精神状态、毛发颜色等。每周称量大鼠的体重并记录。给药后，每周统计一次大鼠24 h 粪便粒数。收集每组大鼠的新鲜粪便，称其湿重，置于烘箱75 ℃干燥至恒重，称重，根据公式计算粪便含水量：

粪便含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%

1.2.3 胃肠传输功能的检测 [6]在第13 周和第26周末次给药的第2 天，每组每只大鼠依次灌服6 粒直径1 mm 钢珠和4 mL 的15%硫酸钡混悬液，然后使用异氟烷麻醉大鼠，并采用X 射线成像监测钢珠在大鼠胃肠道内的位置和数目[5]。根据大鼠胃排空（4 h）、小肠传输（9 h）和大肠传输（12 h）的时间，在这3 个时间点分别追踪观测大鼠胃肠道内的钢珠位置和数目变化。检测指标如下：

胃排空指数：分别计算4、9、12 h 时间点离开胃内的钢珠数与灌胃的总钢珠数目的比值。

胃肠传输指数：胃肠道位置评分（钢珠位于胃内=0；近端小肠=1；远端小肠=2；盲肠=3；结肠=4；直肠=5；排出体外=6）与钢珠粒数的乘积，则全部排出=36。

结肠转运指数：计算9～12 h 内钢珠经由小肠或盲肠进入结直肠或排出体外的数目。

1.2.4 生物样本的收集和肠道组织学评分血清收集：给药13 周和26 周后，大鼠禁食16 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，进行腹主动脉采血。血液样品静置2 h，3000 r·min-1离心15 min 获得血清样本，采用化学试剂法检测总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、肌酐（Crea）和尿素氮（BUN）的含量变化，以及天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）的酶活力，剩余样品置于-80 ℃保存待测。另取血液样品测定红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）等血液学指标。

组织取材：腹主动脉取血，立刻剖取大鼠的肝脏、肾脏、盲肠、结肠组织。用冰生理盐水冲洗干净，称取肝脏和肾脏重量，置-80 ℃的冰箱保存待测。另取部分结肠、盲肠、肝脏、肾脏置于4%福尔马林中固定，石蜡包埋切片，H&E 染色，显微镜观察拍照。

肠道组织学评分：组织学评分为颜色评分与范围评分之和。颜色：鲜红者0 分；浅褐色1 分；暗褐色2 分；深褐色3 分。范围：无黑变者0 分；盲肠部位1 分；近端结肠部位2 分；全结肠3 分。

结肠组织粘蛋白2（MUC2）含量测定：取近端结肠组织0.1 g，用冰PBS 缓冲液冲洗表面残留血迹，加入一定体积的PBS 缓冲液（1∶9 的重量体积比），用组织研磨器研磨90 s，将匀浆液于4 ℃、10 000 r·min-1离心30 min，收集上清液。该液按ELISA 试剂盒说明书步骤进行检测，于波长450 nm 处测量OD 值。

1.3 数据处理

以GraphPad Prime 8 软件分析数据。所有数据用均值±标准差（）表示，样本均数间比较用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t 检验。P<0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 天天胶囊对正常大鼠体重和进食量影响

如图1-A 所示，灌胃给药13 周和26 周后，与空白组相比，芦荟低、高剂量组和天天胶囊低、高剂量组实验大鼠体重无显著性差异（P>0.05），提示天天胶囊不影响大鼠体重变化。如图1-B 所示，各组实验大鼠进食量也无明显差异（P>0.05），提示天天胶囊对大鼠进食量无影响。

2.2 天天胶囊对正常大鼠排便粒数和粪便含水量影响

如图1-C 所示，与空白组相比，给药13 周和给药26 周的芦荟低、高剂量组和天天胶囊低、高剂量组的大鼠排便粒数均显著性增加，提示芦荟和天天胶囊均能促进大鼠排便。如图1-D 所示，与空白组相比，给药13 周和26 周的芦荟低、高剂量组和天天胶囊低、高剂量组大鼠粪便含水量差异无统计学意义（P>0.05），提示芦荟和天天胶囊对大鼠的粪便含水量影响较小。

图1 天天胶囊对正常大鼠体重和进食量影响（n=10）

2.3 天天胶囊对大鼠胃肠传输功能影响

如图2 所示，腹部X 射线图像显示了各组大鼠分别在灌胃4、9、12h 后，钢珠在胃肠道中的数目和位置。在灌胃给药13 周和26 周后，与空白组相比，在灌胃4、7、12h 后，各给药组的胃排空指数均没有显著性差异（图3-A、图3-B，P>0.05），说明天天胶囊不影响大鼠的胃排空能力。如图3-C 和3-D 所示，与空白组相比，灌胃13 周和26 周后，各组的大鼠胃肠传输指数在4h 和9h 均无显著性差异（P>0.05），而在12h 芦荟高剂量组和天天胶囊高剂量组的大鼠胃肠传输指数显著升高（P<0.05），说明天天胶囊高剂量可促进正常大鼠胃肠道传输功能。在9h 后大鼠体内钢珠经过肠道蠕动进入结直肠内。在灌胃13 周和26 周后，芦荟高剂量组和天天胶囊高剂量组的大鼠中进入结直肠的钢珠数目较空白组明显增加（图3-E、图3-F，P<0.05），结合胃肠传输指数的变化，说明芦荟高剂量和天天胶囊高剂量增强了大鼠的结肠转运能力。

图2 大鼠胃肠传输的X-射线图像

图3 天天胶囊对大鼠胃肠传输的影响（n=3）

2.4 天天胶囊对大鼠血液学变化的影响

如表1 所示，给药26 周后，与空白组相比，芦荟低、高剂量组和天天胶囊低、高剂量组的大鼠红细胞、血红蛋白、血小板和白细胞数等均无明显差异（P>0.05），炎性细胞如淋巴细胞、嗜酸性细胞、中性粒细胞数目等也无显著性差异（P>0.05），说明天天胶囊不影响大鼠血液指标的变化。

表1 给药26 周后天天胶囊对大鼠血液指标的影响（n=10）

2.5 天天胶囊对盲肠、结肠组织的影响

如图4-A 所示，给药13 周和26 周后，与空白组相比，芦荟低、高剂量组和天天胶囊低、高剂量组的大鼠结肠组织均颜色鲜红，无棕褐色色素沉着，同时结肠组织评分均为0，表明芦荟低、高剂量组和天天胶囊低、高剂量组均未造成大鼠结肠黑变。

如图4-B、图4-C 所示，给药13 周和26 周的芦荟低、高剂量组和天天胶囊低、高剂量组的大鼠盲肠微绒毛正常，黏膜上皮细胞结构正常，无炎性细胞浸润，且未见棕黄色颗粒物。与空白组相比，芦荟两组和天天胶囊两组的大鼠结肠黏膜上皮细胞均结构完整，空泡状杯状细胞数目增加，无炎性细胞浸润，无浆膜水肿，也未观察到棕黄色的颗粒状物。

图4 大鼠结肠和盲肠的病理变化（n=3）

2.6 天天胶囊对大鼠肝肾功能影响

如表2 所示，给药26 周后，与空白组相比，天天胶囊低剂量组的ALT 显著性降低（P<0.01），芦荟低剂量组TP 明显升高（P<0.05），其他指标如AST 和ALB，各组之间均无明显变化。与空白组相比，芦荟低、高剂量组和天天胶囊低、高剂量组BUN 无显著性差异，而芦荟高剂量组的Crea 显著升高（P<0.05），天天胶囊的两组的Crea 无明显变化。结果提示，给予天天胶囊的大鼠肝肾功能均正常，未见明显病理损伤。

表2 给药26 周后天天胶囊对大鼠肝、肾生化指标的影响（n=10）

如图5 所示，给药13 周后，各给药组的大鼠肝肾指数与空白组相比，均无显著性差异（P>0.05）。给药26 周，天天胶囊的两组的大鼠肾脏脏器指数未见显著性差异（P>0.05），而芦荟高剂量组的肾脏脏器指数显著性升高（P<0.05）。如图5-B 所示，在给药13 周和26 周后，与空白组相比，各给药组的肝脏无炎性细胞的浸润，肝细胞无水样变性，无脂滴样物质，未见大小不等的空泡形成，表明天天胶囊无肝毒性。如图5-C 所示，大鼠给药13 周各给药组未见肾脏病理损伤。给药26 周的芦荟高剂量组肾脏出现空泡变性，肾小球体积数目增加，而天天胶囊的两组肾脏无明显病理改变，未见染色深的核固缩细胞，细胞结构完整，提示天天胶囊不会造成大鼠的肾脏损伤。

图5 大鼠肝、肾脏器指数及组织病理学分析

2.7 天天胶囊对大鼠结肠杯状细胞、肠黏膜厚度和MUC2 表达影响

如图6-A 所示，在大鼠给药13 周、16 周后，与空白组相比，芦荟高剂量和天天胶囊高剂量组的结肠杯状细胞数目显著增加（P<0.05 或P<0.01）。如图6-B 所示，给药13 周、16 周的芦荟高剂量组和天天胶囊高剂量组肠黏膜厚度显著增加（P<0.01、P<0.01），天天胶囊低剂量组在26 周结肠黏膜厚度增加，也有统计学意义。与空白组相比，给药13 周和26 周后，天天胶囊低、高剂量组结肠肠壁厚度变化均无显著性差异（图6-C，P>0.05），结肠组织中MUC2 蛋白表达也无明显差异（图6-D，P>0.05），与图7 的结肠组织阿尔新蓝染色的结果一致，提示天天胶囊对正常大鼠MUC2 蛋白的分泌影响较小。

图6 天天胶囊对大鼠结肠杯状细胞数量、黏膜层厚度、粘液层厚度和粘蛋白2 表达的影响（n=10）

图7 阿尔新蓝染色结肠粘液层（×200）

3 讨论

本实验连续给予天天胶囊13 周和26 周，大鼠的肠黏膜未见棕褐色的色素颗粒沉着，未出现结肠黑变，未见肝肾病变损伤，天天胶囊可促进大鼠胃肠传输和结肠转运。此外，天天胶囊可促进大鼠的结肠杯状细胞数目和肠黏膜厚度的增加。

黑肠病是指褐色素的物质沉积在结肠黏膜固有层中的非炎症性肠病。一般认为长期服用蒽醌类泻药是引起结肠黑变的诱因之一，临床上报道超过70%的患者长期（平均9 个月以上）使用芦荟等蒽醌类泻药会出现结肠黑变[7]。此外，文献报道给予SD大鼠2 g·kg-1芦荟全叶粉90 天，可见大鼠结肠黏膜固有层色素沉着[8]。而本研究中高剂量天天胶囊中所含芦荟剂量为0.1 g·kg-1，远低于文献报道的给药剂量，因此推测天天胶囊未出现大鼠结肠黑变，可能与芦荟的给药剂量较低有关。另有报道服用2 g·kg-1大黄30 天即可建立豚鼠结肠黑变病的模型[9]，比相同剂量芦荟造成结肠黑变病的时间更短。这可能是由于大黄和芦荟中所含的蒽醌类型不同引起的，化学成分研究结果表明，大黄中多为双核蒽醌结构，芦荟中主要是单核蒽醌。因此推测结肠黑变病的发生还可能与蒽醌的种类和结构有关。

动物实验表明，低剂量（50 mg·kg-1）的芦荟大黄素预处理能够减轻CCl4引起的大鼠急性肝损伤[10]，高剂量（2 g·kg-1）的大黄素则会损害肝脏[11]。本实验发现，给予芦荟和天天胶囊13 周和26 周后大鼠肝脏均无炎性细胞浸润的病理改变，并未造成肝损伤。因此推测可能是天天胶囊中所使用芦荟的品种、产地不同，其中所含蒽醌成分的种类和含量差异影响其对肝脏的作用，但此问题有待深入研究。

临床研究还发现，有人长期服用芦荟制品诱发了急性肾功能衰竭[8]，文献报道正常大鼠连续14 天服用0.2 mL 99.8%%芦荟凝胶出现明显的肾毒性，且肾损伤程度呈剂量依赖性[12]。本研究发现，给药13 周后各组大鼠肾脏BUN 和Crea 无明显变化，而给药26 周后芦荟高剂量组的大鼠Crea 和肾脏脏器指数却显著性升高，病理结果也显示部分大鼠出现肾脏损伤的病理改变。本研究进一步证明，长期大剂量服用芦荟会对大鼠造成肾损伤，此结果与上述文献报道一致。研究显示，造成肾脏毒性的物质主要是芦荟苷的氧化产物——芦荟大黄素[13]。但实验中天天胶囊低、高剂量组均未出现肾脏功能和病理上的变化。推测可能是天天胶囊的组方以某种方式改变了芦荟肾毒性成分的吸收与代谢，从而降低了芦荟的肾毒性，但该假设还有待验证。

肠黏膜增生以杯状细胞数目的增加导致肠黏膜增厚为主要特征，是一种非肿瘤性变化。杯状细胞主要功能是分泌粘液蛋白，其主要成分是MUC2，粘液蛋白进入肠腔后，能够与水等物质结合形成黏液，可以润滑肠道，增强肠道传输功能，促进排便。研究发现，服用尿苷等药物能够恢复便秘大鼠减少的杯状细胞数目、甚至增加其数目，从而改善便秘[14]。在文献报道中，服用芦荟苷会引发从盲肠延伸到直肠的黏膜和杯状细胞增生[15]，本研究显示类似的实验结果。因此，推测促进杯状细胞增加可能是天天胶囊改善便秘的机制之一。

有研究证实，缺乏黏蛋白MUC2 的小鼠因结肠黏液层变薄自发地发展为结肠炎[16]，且在大鼠溃疡性结肠炎模型中，观察到结肠病变附近分泌黏蛋白的杯状细胞已被耗尽[17]，说明黏液层损伤与结肠炎的形成有关。肠道的黏液层主要由黏蛋白组成，能够阻止细菌等微生物进入肠道，当黏液层增加时，可预防和治疗炎症肠病[18]。本研究发现，天天胶囊能够促进杯状细胞和肠道黏液增加，因此推测天天胶囊可能会对炎性肠病有一定的治疗作用。

天天胶囊长期服用可促进胃肠传输功能和结肠转运，且未见明显的毒副作用。