中药材昆布中25 种溴系阻燃剂残留量的测定和风险评估*

李珂瑜，孙 晶，曹 玲，谭 力，王沁怡，杭太俊**，冯有龙**

1 中国药科大学 药学院，南京 211198；2 江苏省食品药品监督检验研究院，南京210019

溴系阻燃剂（brominated flame retardants，BFRs）是一类典型的持久性有机污染物（persistent organic pollutants，POPs），在环境中广泛存在，具有环境持久性、远距离大气运输、生物蓄积性和强烈的生物毒性等特性。BFRs 通常用于电子电气设备、纺织品、塑料、建筑材料等[1]。市售BFRs 主要包括多溴二苯醚（polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）、六溴环十二烷（hexabromocyclododecane，HBCD）和四溴双酚A（tetrabromobisphenol A，TBBPA）以及一系列新兴溴化阻燃剂（emerging BFRs，eBFRs）。PBDEs 是一类应用最为广泛的添加型BFRs，分子式为C12H（9-0）Br（1-10）O，理论上同源物有209 种，取决于两个苯环上Br 原子的数量和位置，分为10 个同族物（单溴代到十溴代）。毒理学研究表明，PBDEs 会影响人的神经系统发育、内分泌系统、认知能力、运动功能等[2]，PBDEs 的三种商业产品五溴二苯醚（pentabromodiphenyl ether，pentaBDE）、八溴二苯醚（octabromodiphenyl ether，octaBDE）和十溴二苯醚（decabromodiphenyl ether，decaBDE）已于2009 年和2017 年被列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》（POPs 公约）受控名单，禁止生产使用。我国于2014 年禁止了商业pentaBDE、octaBDE 的生产使用，但到目前为止，decaBDE 在中国尚未受到限制[3]。由于PBDEs 的逐步禁用，eBFRs 作为PBDEs 的替代品得到了广泛应用，包括六溴苯（hexabromobenzene，HBB）、五溴甲苯（pentabromotoluene，PBT）、1，2-二（2，4，6-三溴苯氧基）乙烷[1，2-bis（2，4，6-tribromophenoxy）ethane，BTBPE]和十溴二苯乙烷（decabromodiphenylethane，DBDPE）等[4]，其中DBDPE 已成为中国市场上生产和使用最多的eBFRs[5]。

中药材大部分来自动植物，它们的生长、发育与周围自然环境密切相关。现阶段，国内对于中药材中POPs 的研究主要是有机氯农药残留，仅几篇文献报道中药材中另一类POPs 多氯联苯的残留[6]，而对于中药材中BFRs 的研究知之甚少。昆布是一种生活在海洋里的大型褐藻，其药用来源是海带科植物海带Laminaria japonica Aresch 或翅藻科植物昆布Ecklonia kurome Okam 的干燥叶状体，具有软坚散结、消痰、利水之功[7]，多分布于我国辽宁、山东、浙江和福建东部，多位于我国BFRs 的重污染区。因此，建立中药材中BFRs 残留量的测定方法并评估其潜在风险对于评估中药安全性具有重要的现实意义。

1 材 料

1.1 仪器

7890A-7000B 气相色谱-三重四极杆质谱联用仪（配CI 离子源，美国Agilent 公司）；XP6 百万分之一分析天平（Mettler Toledo 公司)；UA22MFD 超声波清洗仪（德国Wiggens 公司）。

1.2 药品与试剂

BDE-47、-66、-69、-71、-85、-99、-100、-138、-153、-154、-183、-190、-196、-197、-203、-205、-206、-207、-208、-209、BTBPE、DBDPE 的对照品均购自美国AccuStandards Inc 公司，其中DBDPE 质量分数＞99.5%，BTBPE 的质量浓度为100 μg·mL-1，其余PBDEs 对照品的质量浓度为50 μg·mL-1；BDE-201、-202 对照品购自Wellington Laboratories Inc 公司，质量浓度为50 μg·mL-1；HBB 对照品购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH，质量分数＞99.5%。内标BDE-77、-118、-181 购自美国AccuStandards Inc 公司，质量浓度均为50 μg·mL-1；13C12-BDE-209 购自美国剑桥同位素实验室，质量浓度为50 μg·mL-1。

正己烷、甲醇、异辛烷、甲苯均为色谱纯（德国Merck 公司）；二氯甲烷为色谱纯（美国Anaqua Chemicals Supply 公司）；浓硫酸、氢氧化钠均为优级纯，购自南京化学试剂公司；无水硫酸钠（农残级）购自上海阿拉丁生化科技股份公司；硅胶（分析纯，100～200 目）购自青岛海洋化工公司；硅镁合剂（分析纯，100～200 目）购自国药集团化学试剂公司。

共收集了19 批昆布和4 批海带。经江苏省食品药品监督检验研究院胡浩彬鉴定均为合格的药材。样品编号为S1～S19，其中S1～S3 产地为浙江；S4～S8 产地为福建；S9～S11 产地为辽宁；S12～S14 产地为广东；S15～S19 产地为山东。海带为市售品，编号为S20～S23，产地分别为辽宁、福建、山东、福建。

1.3 实验材料预处理

正己烷和异辛烷使用前需经过2 次蒸馏。

无水硫酸钠用前于马弗炉450 ℃活化6 h，冷却密封，保存于干燥器中；硅胶和硅镁合剂用前依次以甲醇和二氯甲烷超声清洗2 次，晾干后分别以450 ℃和180 ℃活化6 h，冷却密封，保存于干燥器中。

2%碱性硅胶：取活化硅胶98 g，加入0.05 g·mL-1NaOH 溶液40 mL，充分混匀后放置12 h 备用。

44%或50%酸性硅胶：取活化硅胶分别为56 g和50 g，加入浓硫酸44 g 或50 g，充分混匀后放置12 h 备用。

2 方法与结果

2.1 仪器条件

2.1.1 色谱条件色谱柱：AgilentDB-5MS（15 m×0.25mm，0.1μm）；进样方式：脉冲不分流进样（30psi，维持1 min）；进样体积：1 μL；进样口温度：290 ℃；载气：高纯氦气（纯度>99.999%）；流速1.0 mL·min-1；程序升温：初始温度90 ℃，保持0.5 min，以15 ℃·min-1的速率升高到180 ℃，然后以10 ℃·min-1的速率升至315 ℃并保持5 min。

2.1.2 质谱条件负化学电离模式（NCI），甲烷反应气，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，传输线温度300 ℃，溶剂延迟时间10 min，离子监测模式（SIM）。化合物和内标的保留时间、质谱参数见表1。

表1 目标化合物的保留时间和质谱检测离子信息

2.2 对照品溶液的配制

DBDPE 对照品储备液（40 μg·mL-1）：精密称取DBDPE 对照品1.0 mg 置25 mL 量瓶中，用甲苯溶解并稀释至刻度，混匀，即得。

HBB 对照品储备液（50 μg·mL-1）：精密称取HBB 对照品1.0 mg 置20 mL 量瓶中，用异辛烷溶解并稀释至刻度，混匀，即得。

混合对照品储备液：精密量取BTBPE 对照品（100 μg·mL-1）20μL，BDE-209 对照品（50 μg·mL-1）200 μL，DBDPE 对照品储备液400 μL，其余对照品（50 μg·mL-1）40 μL，置同一50 mL 量瓶中，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，即得。

定量内标溶液：分别精密量取BDE-77、-118对照品（50 μg·mL-1）各10 μL 和13C12-BDE-209 对照品（50 μg·mL-1）25 μL，置同一250 mL 量瓶中，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，即得。

进样内标溶液：精密量取BDE-181 对照品（50 μg·mL-1）10 μL 置250mL 量瓶中，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 样品提取取昆布药材，研细。准确称取1.0g，与无水硫酸钠2.0 g 混匀置150 mL 玻璃碘量瓶中，精密加入定量内标溶液200 μL，加入正己烷-二氯甲烷（1∶1，v/v）混合溶剂70 mL 超声提取（59 kHz，500 W）30 min，加入50%酸性硅胶7 g 混匀，静置过夜（约15 h）超声提取20 min，取上清液置250 mL 茄形瓶中，残渣中再次加入正己烷-二氯甲烷40 mL（1∶1，v/v）超声提取20 min，重复操作1 次，合并有机萃取液，旋蒸浓缩至1～2 mL，并置换溶剂为正己烷。

2.3.2 样品净化采用复合硅胶柱进行样品净化。层析柱底部用脱脂棉封堵，加入40 mL 正己烷，从下往上依次填充1.5 g 无水硫酸钠、1.0 g 中性硅胶、2.0 g硅镁合剂、1.0 g 中性硅胶、4.0 g 2%碱性硅胶、1.0 g中性硅胶、8.0 g 44%酸性硅胶、1.0 g 中性硅胶、1.5 g无水硫酸钠。使用前依次使用二氯甲烷30 mL、正己烷15 mL 清洗复合硅胶柱。

将上述提取浓缩液全部转移到复合硅胶柱上（5 mL 正己烷荡洗茄形瓶3 次），用正己烷-二氯甲烷（1∶1，v/v）120 mL 洗脱，收集洗脱液，旋蒸浓缩至约1 mL，用正己烷约5 mL 分3 次转移浓缩液至10 mL离心管中，室温下离心浓缩挥干，精密加入进样内标溶液200 μL 复溶，涡旋10 s，转移至玻璃衬管待测。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察按“2.3”项下方法制备供试品溶液，同法处理添加内标的方法空白，向200 μL 供试品溶液中加入混合对照品储备液10 μL，即得系统适用性溶液。注入GC-MS 分析，结果表明方法空白中无污染物干扰，昆布样品在内标处无干扰，各目标分离度良好，见图1。

图1 25 种分析物GC-NCI-MS 典型总离子流色谱图

2.4.2 线性与范围精密量取“2.2”项下混合对照品储备液和内标溶液适量，配制成含BDE-69 质量浓度为0.010、0.050、0.20、0.50、2.0、5.0、10 ng·mL-1的系列标准溶液，其中内标的质量浓度为含BDE-118 2 ng·mL-1。按“2.1”项下仪器条件测定，记录峰面积。以目标物与内标物质浓度比值为横坐标（BDE-209和DBDPE 的内标为13C12-BDE-209，其余均为BDE-118），峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表2。各目标化合物在各自的线性范围内呈良好的线性关系。

2.4.3 检测限和定量限向200 μL 供试品溶液中加入10 μL 低浓度混合对照品溶液，进样测定。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别确定为3 倍和10 倍的信噪比（S/N），计算得出检测限和定量限分别为0.000 2～0.030 ng·g-1和0.000 6～0.090 ng·g-1（见表2）。

表2 线性范围、线性方程、相关系数、LOD 和LOQ

2.4.4 方法回收率和精密度取昆布S6-S8 混合样品约50 g 作为基质空白样品，研细，准确称取1.0 g，共11 份，分别添加低、中、高3 个浓度水平的混合标准溶液，每个加标水平3 份，其中BDE-209 加入量为0.5、2、8 ng·g-1，DPDBE 加入量为0.8、3.2、12.8 ng·g-1，其余阻燃剂加入量为0.1、0.4、1.6 ng·g-1，2 份用于监测本底水平。照“2.3”项下处理，进样测定。取低、中、高浓度水平混合标准溶液各1 份，连续进样6 次，记录峰面积，测定进样精密度，结果见表3。方法平均回收率为74.82%～105.3%，RSD 为2.4%～24.2%，精密度为0.6%～8.8%（n=6）。根据美国环境保护署方法1614[8]，对于含3～9 个溴原子的PBDEs，其回收率应在50%～150%，而对于BDE-209，其回收率可在40%～200%，表明分析方法的准确度较高。

表3 各目标化合物的平均回收率

2.5 实际样品测定

采用上述建立的方法测定昆布中各目标物的残留量。23 批昆布样品BFRs 残留量的统计信息见表4。共检出BFRs22 种，BDE-69、-85、-138 低于检测限，BDE-196、-197、-201、-206、-207、-208、-209、DBDPE 是样品中发现的主要单体，检出率较高（>90%）。昆布样品中∑PBDEs 的浓度范围为0.24～30.3ng·g-1，平均值为2.72ng·g-1，而∑eBFRs 的浓度范围为0.44～8.42ng·g-1，平均值为1.99ng·g-1（见表4）。

表4 昆布样品中目标物的浓度（ng·g-1）和检出率（%）

2.6 风险评估

由于目前尚未建立中药材中BFRs 的风险评估方法，参考欧洲食品安全局（EFSA）建议的暴露限值（MOE）方法，评估摄入BFRs 的健康风险[9]。MOE 定义为引起10%不良反应的基准剂量下限值（BMDL10）与估计的每日摄入量（EDI）的比值，MOE＞2.5 表明不太可能造成健康问题[9]。根据对神经发育的影响作为毒理终点，相关毒性数据仅适用于BDE-47、-99、-153、-209，ESFA 建议的BMDL10分别为172、4.2、9.6 ng·kg-1·day-1和1.7 mg·kg-1·day-1（kg 指体重）[9]。

据国家食品安全风险评估指南对风险评估数据的要求[10]，未检出结果按LOD 计算，污染物残留量取均值评估长期膳食暴露风险。参考左甜甜等[11]报道的中药材农药残留暴露评估方法，估算中药材中PBDEs 的EDI，结果见表5 EDI 1。同时，在食品的暴露评估中EDI 估算为食品中污染物浓度乘以每日消费量、除以人体质量（以63 kg 计）[9]。本研究按昆布最大日消费量100 g 估算，见表5 EDI 2。

表5 BDE-47、-99、-153 和-209 的暴露限值

按中药和食品两种方法估算EDI，调查的昆布样品中BDE-47、99、153、209、MOE 值均＞EFSA 设定的阈值2.5，表明其摄入的健康风险关注度较低。

3 讨论

3.1 提取条件的选择

索氏提取法是持久性有机污染物痕量分析的经典方法，但索氏提取法提取时间相对较长（需回流24 h）且消耗溶剂量较大，对于处理大批量的样品并不是很好的选择。超声辅助提取可以增加目标分析物向液相的传质过程，缩短了样品前处理时间，样本通量高，溶剂使用量有所减少。

在生物样品中，POPs 的测定通常需排除脂质的干扰，一般利用凝胶渗透色谱法或浓硫酸。本研究改进了传统方法在萃取液中直接加入浓硫酸溶液或酸性硅胶的方法，在提取前预加入50%酸性硅胶，去除脂质的同时还可使酸性硅胶有效附着中药材成饼状，有利于上清液的倾倒；但酸性硅胶会吸附部分提取溶剂，需相对增加溶剂以补偿回收率的损失。

3.2 SIM 模式下BFRs 残留量分析方法的建立

在GC-NCI-MS 分析中，一般使用SIM 模式监测溴离子[Br]-（m/z 79、81）来实现定性定量，NCI-MS对溴更灵敏，但选择性低。昆布等藻类海洋生物基质中存在一些天然的含溴化合物，对选择监测[Br]-（m/z 79、81）作为定量离子会产生干扰。实验过程中发现仅监测[Br]-谱图基线较高，专属性较差，干扰目标物质分离。在NCI 离子源全扫描模式下，PBDEs 同族物呈现顺序脱溴的质谱碎片，产生一系列[HBr2]-、[MHBr]-、[M-HBr2]-、[M-HBr3]-、[M-HBr4]-的碎片离子。本研究中含有4～7 个溴取代的PBDEs，[HBr2]-（m/z 160.8）离子丰度仅次于[Br]-。据相关报道[12]，碎片离子[HBr2]-是2，4 位或2，6 位取代的PBDEs 的特征离子，且丰度随溴原子数增加逐渐增强。具有某些特定取代位的含8～10 个溴原子PBDEs 同族物会发生醚键断裂，产生[C6HxBryO]-的碎片离子丰度较大。[C6HBr4O]-（m/z 408.6）碎片离子丰度主要与邻位溴的取代有关，八溴二苯醚BDE-202、201、197 两个苯环上均为4 个溴取代（记为4，4 取代，下同）且邻位均被溴取代发生醚键断裂，产生m/z 408.6 碎片离子丰度略大于[Br]-；而两个苯环为5，3 取代的八溴二苯醚BDE-203、205和4，4 取代的BDE-196 以及九溴二苯醚BDE-206（5，4 取代）的[C6HBr4O]-（m/z 408.6）离子丰度均较小，其共同点是有一个未被取代的邻位溴。九溴和十溴二苯醚醚键断裂产生[C6Br5O]-（m/z 486.6）的特征碎片离子。BDE-209 同位素峰[C6Br5O]-（m/z 492.6 理论丰度为3.1%）对13C12BDE-209 定量产生影响（[13C6Br5O]-最高丰度碎片离子为m/z 492.6），因此，选择m/z 494.6 和496.6 作为13C12BDE-209 的定性定量离子。HBB 以分子离子峰[C6Br6]-定量，BTBPE 以醚键断裂后失掉一个溴原子[C6H2Br2O]-（m/z 250.9）为定量离子，DBDPE 以[Br]-（m/z 79、81）定性定量。优化后的定量离子结合保留时间可准确测定昆布样品中的BFRs 含量，专属性良好。

3.3 中药材昆布BFRs 残留量特征

昆布样品中普遍残留有BFRs 污染物，其中BDE-209 和DBDPE 是主要的同族物，分别占∑PBDEs 的59.1%～95.7%、∑eBFRs 的85.6%～100%。PBDEs 同族物分布模式与报道中大型藻类的分布模式基本一致，高溴化同族物占主导[13]。广东大亚湾和海陵湾的大型藻类样本中∑PBDEs 浓度范围在0.22～12.53ng·g-1，平均值为4.08ng·g-1，其中BDE-209 平均浓度为3.54ng·g-1[13]，与本研究PBDEs 含量相近。与2004 年收集自日本的海带、裙带菜等样品相比，BDE-47、-100、-153 的含量相似（0.1～4.7pg·g-1），但BDE-99、-154、-183 的含量较本研究低3～10 倍（0.1～1.7pg·g-1）[14]。2011 年第五次中国总膳食研究（TDS）测定了20 个省份食物中的PBDEs，动物性食物中的PBDEs平均水平为11.5～316 pg·g-1（以湿重计），植物性食物则相对较低，平均水平为5.81～18.4 pg·g-1[3]，TDS 植物性食品的污染水平与本研究相当或略低。

PBDEs 的最高水平达30.3 ng·g-1，在福建海带S23 中发现，其次是山东昆布S19（4.68 ng·g-1）；在浙江的昆布S3 样品中发现eBFRs 最高含量，为8.42 ng·g-1，福建海带S23（7.99 ng·g-1）次之。尽管目前发现的风险水平较低，但在我国溴系阻燃剂高风险地区，其对中药材产地环境的影响应予以重视。