苦参碱对HCCLM3 人高转移性肝癌细胞体外转移的作用及机制研究

席 昱，汪瑞辰，周宋汇

江苏省肿瘤医院，江苏省肿瘤防治研究所，南京医科大学附属肿瘤医院，南京210009

随着生活环境和饮食习惯的改变，恶性肿瘤的发病率逐年增高，尽管诊疗策略和临床技术的不断提高，但是恶性肿瘤转移依然是致死的主要因素[1]。肝癌是一种常见的恶性肿瘤，其致死人数仅次于肺癌，严重影响了人们的生命健康安全[2]。目前，尽管对于早期肝癌可以通过手术切除、辅以全身化疗的策略以提高患者生存期；但是，在肝癌的诊断过程中，早期肝癌的诊断率极低，同时肝癌细胞又具极强的转移能力，很多患者在确诊时已经处于肝癌的中晚期并伴随着肝癌细胞的转移，大大缩短了患者的生存期。目前靶向制剂索拉菲尼依然是转移性肝癌治疗的一线用药[3]，尽管其在一定程度上提高了转移性肝癌患者的总体生存质量；但是索拉菲尼存在厌食、疲劳以及消化道方面的不良反应，严重影响了药物治疗的有效性，导致治疗的失败。因此，研发高效、低毒、价廉的抗肝癌转移药物是当前肝癌治疗的难点和重点。

当前研究表明，肿瘤细胞发生上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肝癌细胞发生转移的主要方式[4]，在EMT 过程中，肿瘤细胞由上皮样转变成为间质样，细胞的运动能力、侵袭和转移能力显著增加。同时，在癌细胞发生转移的过程中需要分泌较多的细胞外基质金属蛋白酶（Matrix Metalloprotinase，MMP），以降解坚硬的细胞外基质，实现癌细胞远处转移和侵袭，其中MMP-2 和MMP-9 是要降解细胞外基质的蛋白酶[5,6]，因而也是肿瘤转移过程中的重要靶标。

苦参碱是中药苦参中的主要活性成分，研究已经表明其具有一定的抗病毒和抗多种肿瘤的药理学特性[7]。基于此，本研究利用HCCLM3 人高转移性的肝癌细胞，探求苦参碱体外抗肝癌细胞转移的作用及机制，以期为药物研究和临床治疗提供实验依据。

1 实验材料

1.1 细胞株

人肝癌高转移细胞株HCCLM3，购自于武汉Procell 生命科技有限公司。该癌细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中。

1.2 药品与试剂

苦参碱（纯度≥98%，批号：M109843）购自阿拉丁试剂（上海）公司；DMEM 培养基（批号：20200418）购自江苏凯基生物公司；胎牛血清（批号：H2319）购自美国Hyclone；Matrigel 基底胶（批号：6439228）购自美国BD 公司；瑞氏-吉姆萨染色液（批号：205347）购自武汉塞维尔生物科技公司；E-cadherin（E-钙粘蛋白，20874-1-AP）、N-cadherin（N-钙粘蛋白，22018-1-AP）、Vimentin（波形蛋白，10366-1-AP）蛋白一抗、蛋白二抗均购自于武汉Proteintech生物技术公司；MMP -2（ab97779），MMP -9（ab228402）蛋白一抗均购自美国Abcam 公司；其余试剂均为分析纯。

1.3 实验仪器

分析天平，BSA224S 型，购自德国赛多利斯公司；多功能酶标仪，型号Multiskan Fc，购自美国Thermo 公司；蛋白凝胶成像系统，型号GelDoc 2000，购自美国Bio-RAD 公司；倒置显微镜，型号Axio Observer，购自德国Zeiss 公司。

2 实验方法

2.1 CCK-8 细胞增殖实验检测苦参碱对HCCLM3 癌细胞增殖的影响

取对数生长期的HCCLM3 癌细胞，经胰酶消化后，细胞培养基重悬细胞计数加入96 孔细胞培养板中，每孔的细胞数为1×104个，加入200 μL 的完全培养基培养过夜，使细胞贴壁。弃去培养基，分别加入预先配制好的0、4、8、16、32、64、128 mg·mL-1的苦参碱含药培养基于设定的细胞孔中，每个剂量组设置6个复孔，继续培养24 和48 h。待药物作用完毕，小心吸去培养基，重新更换新的培养基后每个细胞孔中加入10 μL 的CCK-8 溶液，充分混匀，继续将细胞培养板置于37 ℃培养箱中继续孵育2 h。待培养板孵育结束后，取出培养板置于酶标仪中检测450 nm 波长处的吸光度值A450。计算细胞增殖抑制率。

抑制率（%）=（1-A药物组/A对照组）×100%。

2.2 细胞划痕检测苦参碱对HCCLM3 癌细胞迁移的影响

取对数生长期的HCCLM3 癌细胞，经胰酶消化，培养基重悬后接种于6 孔细胞培养板中，每孔接种的细胞数量为4×105个。将细胞培养板置于37℃培养箱中培养24 h，Marker 笔进行标记后，采用白色10 μL 移液器枪头沿孔板中线进行垂直划痕，PBS 洗涤两次后置于显微镜下观察，分设4 组：苦参碱0、4、8、16 mg·mL-1组，每组设置6 个复孔，分别加入2 mL 含有药物的新鲜培养基继续置于37 ℃培养箱中培养。培养24 h 后于显微镜下观察，并进行拍照（×100 倍）。

细胞迁移率（%）=（划痕宽度1～24h/划痕宽度0h 时间点）×100%。

2.3 Transwell 小室检测苦参碱对HCCLM3 癌细胞侵袭的影响

于实验前一天在Transwell 小室的上室，采用培养基4 倍稀释的Matrigel 胶，均匀铺被完成后将整个小室置于37 ℃培养箱中培养过夜，使该胶充分凝固。将5×103个HCCLM3 癌细胞种植于上室，上室的培养体系为100 μL 的含药培养基。实验分设4组：苦参碱0、4、8、16 mg·mL-1组，每组设置6 个平行复孔。Transwell 小室下室加入含有20%小牛血清的完全培养基，将整个小室置于37 ℃培养箱中继续培养24 h。待药物作用结束后，采用棉签轻轻将未侵袭的细胞刮去，以PBS 洗涤2 次，4%多聚甲醛充分固定15 min，PBS 洗去固定液，参照瑞氏吉姆萨染色液实验方法进行染色后，将上室底部的膜剪下贴于载玻片上，显微镜下随机选取5 个视野进行拍照，计数视野的平均的侵袭细胞数量。

2.4 RT-PCR 检测HCCLM3 癌细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 和MMP-9基因mRNA 的表达

取对数生长期的HCCLM3 癌细胞，经胰酶消化后进行计数，接种于6 孔细胞培养板中，每孔接种数量为2×105个，接种完毕后补充培养基，调整整个培养体系为2 mL，细胞培养过夜，待细胞完全贴壁后小心吸去培养基，实验分设4 组：苦参碱0、4、8、16 mg·mL-1组，每组设置6 个复孔，加入相应的含药培养基，待药物作用24 h 后，小心弃去培养基，采用无菌PBS 清洗细胞孔3 遍，加入Trizol 充分提取细胞中的全部RNA，采用Nanodrop 计算RNA 含量，以500 ng 总RNA 为模板，参照逆转录试剂盒进行逆转录为相应的cDNA，加入cDNA 和相应的扩增试剂，置于实时定量PCR 仪中进行RT-PCR 检测。以GAPDH 作为内参基因，实验结果以2-△△Ct法计算基因的相对表达量。实验所用引物由上海生工生物公司进行合成，引物序列如下：

E-cadherin：F：5’-ACTACCTTGCCCTGCTAAT-3’；R：5’ -TCTACGCTATCTGGGACTACTT -3’；N -cadherin：F：5’ -GTGCGATTAGCCAATTCAGC -3’；R：5’-GCACTCGAATCCCTAGGAGG-3’；Vimentin：F：F：5’-CGCTTCGCCAACTACAAATC；R：5’-AGCCCATCCACTTCTTACAG-3’；MMP-2：F：5’-ATCAACCAACCTTGACCAA-3’；R：5’-TCAGAGACCGACCCTACAA -3’；MMP -9：F：5’ -GACTCGGTCTTTGAGGAGCC-3’；R：5’-GAACTCACGCGCCAGTAGAA-3’；GAPDH:F：5’-GTCGCCAGCCGAGCCACATC-3’；R：5’-CCAGGCGCCCAATACGACCA-3’。

2.5 Western Blot 法检测HCCLM3 癌细胞Ecadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 和MMP-9蛋白表达

取对数生长期的HCCLM3 癌细胞，经胰酶消化后进行计数，接种于6 孔细胞培养板中，每孔接种2×105个，然后补充培养基，调整整个培养体系为2 mL，细胞培养过夜，待细胞完全贴壁后小心吸去培养基，实验分设4 组：苦参碱0、4、8、16 mg·mL-1组，加入相应的含药培养基，待药物作用24 h 后弃去培养基，采用无菌PBS 清洗细胞孔3 遍，胰酶消化收集全部癌细胞，加入细胞蛋白裂解液后超声破碎细胞，充分使细胞裂解提取全部蛋白，采用NanoDrop仪器检测蛋白含量，将蛋白样品与上样缓冲液按比例充分混匀后制备蛋白样品，制备完毕后按照每孔50 μg 进行上样，并进行SDS-PAGE 蛋白凝胶电泳。然后作蛋白转膜，PVDF 膜经脱脂奶粉封闭后，加入蛋白一抗置于4 ℃冰箱中过夜孵育。第二天吸去蛋白一抗，洗膜后加入蛋白二抗，室温孵育1.5 h，TBST充分洗膜，将膜置于凝胶成像系统中进行曝光拍照，使用ImageJ 软件对条带进行灰度分析。以苦参碱0 mg·mL-1组目标蛋白灰度值计算蛋白相对表达量。

2.6 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计并作单因素方差分析，采用Student-Newman-Keuls post hoc 检验作组间比较，以P<0.05 为差异具有统计学意义。实验图片采用Graph Pad 5.0 进行作图。

3 结果

3.1 苦参碱对HCCLM3 癌细胞增殖的影响

细胞增殖CCK-8 实验结果显示，苦参碱在32、64、128mg·mL-1剂量下，对HCCLM3 癌细胞增殖有明显抑制作用，且与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。而在苦参碱4、8、16 mg·mL-1剂量下对HCCLM3 癌细胞的增殖并不产生抑制作用（P>0.05），见图1。基于这一实验结果，选取4、8、16 mg·mL-1剂量用于苦参碱对HCCLM3 癌细胞迁移侵袭的作用及机制研究。

3.2 苦参碱对HCCLM3 癌细胞迁移的影响

鉴于HCCLM3 癌细胞的迁移能力较强，实验均考察药物作用24h 的迁移和侵袭能力。细胞划痕实验结果显示，苦参碱4、8、16mg·mL-1剂量能够明显减少HCCLM3 细胞的迁移距离并呈现出一定剂量依赖性，且与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05），见图2。

实验结果表明，苦参碱具有较强的抑制HCCLM3癌细胞的迁移能力，进一步采用transwell 实验对其侵袭作用进行研究。

3.3 苦参碱对HCCLM3 癌细胞侵袭的影响

Transwell 小室实验结果显示，在苦参碱4、8、16 mg·mL-1剂量下，HCCLM3 癌细胞侵袭数量明显减少并具有一定剂量依赖性，且与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05），见图3。结果表明，苦参碱能够抑制HCCLM3 癌细胞的侵袭。

图3 苦参碱对HCCLM3 癌细胞Transwell 小室侵袭的影响（，n=6）

3.4 苦参碱对HCCLM3 癌细胞E-cadherin、Ncadherin、Vimentin、MMP-2 和MMP-9 基因mRNA表达的影响

有关研究表明，癌细胞的EMT 是其侵袭和转移的重要过程[8]，与此同时癌细胞为穿透坚硬的细胞外基质还需分泌MMP-2、MMP-9 等多种基质蛋白酶，实现细胞外基质的降解，促进发生EMT 的肿瘤细胞转移。对此采用RT-PCR 对肿瘤细胞EMT 过程中的 E -cadherin、N -cadherin、Vimentin 以 及MMP-2、MMP-9 因子mRNA 的表达水平进行检测。RT-PCR 实验结果显示，在苦参碱8、16 mg·mL-1剂量下，能够明显降低HCCLM3 癌细胞中N-cadherin、Vimentin 以 及MMP-2、MMP-9 因 子mRNA水平，并升高E-cadherin mRNA 水平，且与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05），见图4。

图4 苦参碱对HCCLM3 癌细胞E-cadhein、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 和MMP-9 mRNA 表达的影响（，n=6）

3.5 苦参碱对HCCLM3 癌细胞E-cadherin、Ncadherin、Vimentin、MMP-2 和MMP-9 蛋白表达的影响

采用Western Blot 实验对癌细胞中的转移相关的蛋白水平进行检测，结果表明，苦参碱在4、8、16 mg·mL-1剂量下能明显降低HCCLM3 癌细胞中Ncadherin、Vimentin 以及MMP-2、MMP-9 蛋白水平，并升高E-cadherin 蛋白的水平，且与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05），见图5。实验表明，苦参碱可能通过抑制EMT 过程关键蛋白及MMP-2、MMP-9蛋白发挥抗HCCLM3 癌细胞转移和侵袭作用。

图5 苦参碱对HCCLM3 癌细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 和MMP-9 蛋白表达的影响（，n=3）

4 讨论

苦参碱是中药苦参的主要活性成分，当前临床已经开发出苦参碱注射液用于肝炎的治疗[9]，同时实验研究已表明，苦参碱注射液具有良好的抗肿瘤效应，与化疗药物联合应用治疗结直肠癌能够提高化疗药物的抗肿瘤效应，并减少化疗药物的毒副作用[10]，改善患者的生存质量。此外，研究也表明，苦参碱体外能够剂量依赖性抑制人肝癌细胞HepG2 的增殖等恶性生物学行为，其机制可能与诱导氧化应激和端粒酶活性有关[11]。这些研究表明，苦参碱具有一定的抗肝癌细胞增殖的活性；但是其对于高转移的肝癌细胞转移作用及机制尚不清晰。因此，本研究对苦参碱抗HCCLM3 人高转移肝癌细胞转移的作用及机制进行了研究。

本研究表明，苦参碱在32、64、128 mg·mL-1浓度下，能够剂量依赖性的抑制HCCLM3 癌细胞的增殖；接着选择对肿瘤细胞非直接杀伤的4、8、16 mg·mL-1剂量、研究其对HCCLM3 癌细胞迁移和侵袭能力，结果发现，苦参碱能够剂量依赖性的抑制癌细胞划痕愈合和Transwell 小室癌细胞的侵袭。EMT 过程是癌细胞发生转移和侵袭的作用方式，因而进一步采用RT-PCR 和Western Blot 对HCCLM3 癌细胞在EMT 过程中的关键因子E-cadherin、N-cadherin和Vimentin 的表达水平进行检测，结果发现，苦参碱在4、8、16 mg·mL-1剂量下能够剂量依赖性的减少HCCLM3 癌细胞N-cadherin 和Vimentin 因子mRNA 和蛋白水平，升高E-cadherin 因子mRNA 和蛋白水平，表明苦参碱能够抑制HCCLM3 癌细胞的EMT 过程，发挥抗癌细胞转移的作用。基质金属蛋白酶是肿瘤细胞分泌较多、能够降解ECM 的蛋白酶，癌细胞能够通过分泌MMP-2 和MMP-9 降解坚硬的细胞外基质，为癌细胞的转移和侵袭扫除障碍，因而MMP-2 和MMP-9 也是抑制肿瘤转移的重要靶标[12，13]。因此，本研究对这两个因子的mRNA 和蛋白水平进行检测，结果发现苦参碱在4、8、16 mg·mL-1剂量下能够剂量依赖性的减少HCCLM3 癌细胞MMP-2、MMP-9 因子mRNA 和蛋白水平。这表明苦参碱可能通过抑制MMP-2、MMP-9 表达，以及肿瘤细胞EMT 过程，发挥抗HCCLM3 人肝癌高转移细胞的转移。

综上所述，苦参碱能够抑制人肝癌高转移HCCLM3 细胞的增殖、迁移和侵袭，其抑制HCCLM3癌细胞转移侵袭的作用机制可能是与抑制细胞MMP-2、MMP-9 基质蛋白酶相关因子及EMT 过程有关。实验将进一步通过基因敲除的方式研究苦参碱的作用靶点，为苦参碱后续的抗肝癌转移实验和临床研究提供依据。