HPLC 一测多评法测定神术合剂中广藿香酮等7 个活性成分的含量*

符必述，魏谭军，王 丽，罗健华，杨芝芳，陈 飞，肖 成

达州市中西医结合医院 药学部，四川达州635000

神术合剂处方源于清代医家程国彭《医学心悟》卷三神术散，由苍术（陈土炒）、陈皮、广藿香、厚朴（姜汁炒）、甘草（炙）、砂仁等6 味中药组成，主要用于对时行不正之气，发热头痛、伤食停饮、胸满腹痛、呕吐泻利等病症的治疗。现代研究表明，神术制剂对湿疹、慢性胃炎以及常见妇科病等疗效确切[1]；对呕吐、呃逆、胃脘痛、小儿腹泻等脾胃病疗效显著[2，3]，其联合多潘立酮可有效改善功能性消化不良患者的临床症状[4]；可提高脾虚湿阻型幽门螺旋杆菌临床根除率，改善患者临床症状及体征[5]。神术合剂为本院研发的医院制剂。按照中药质量标志物确认原则，选取君药广藿香的活性成分广藿香酮，臣药苍术（陈土炒）的活性性成分白术内酯Ⅱ、苍术素及佐药陈皮的指标性成分柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素为检测指标，以橙皮苷为内参物，建立一测多评法检测神术合剂上述7 个成分的含量，为建立神术合剂质量标准，全面评价神术合剂产品质量提供数据支持。

1 材 料

1.1 仪器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；LC-20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Sartorius Quintix125D-1CN 型电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 药品与试剂

神术合剂（规格：每瓶装100 mL；批号：200414、200508、200628）本院自制。对照品：白术内酯Ⅱ（纯度：99.9%，批号：111976-201501）、苍术素（纯度：99.5%，批号：111924-201806）、橙皮苷（纯度：96.2%，批号：110721-201818）均购自中国食品药品检定研究院；柚皮芸香苷（纯度：99.7%，批号：18071023）、川陈皮素（纯度：99.9%，批号：18030541）均购自上海同田生物技术公司；橘红素（纯度：98.7%，批号：PRF8063048）、广藿香酮（纯度：99.0%，批号：PRF8072523）均购自成都普瑞法科技公司。乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～11 min，36.0%A；11～20 min，36.0%A→41.0%A；20～36 min，41.0%A →58.0%A；36～44 min，58.0%A→72.0%A；44～50 min，72.0%A→36.0%A）；检测波长分别为270nm（0～20 min 检测白术内酯Ⅱ和苍术素）[6]和310 nm（20～50 min 检测柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素和广藿香酮）[7,8]；柱温：25℃；流速：0.8 mL·min-1；进样量：10 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备

分别精密称取白术内酯Ⅱ、苍术素、柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素、广藿香酮对照品适量，用甲醇制成质量浓度分别为0.474、1.056、0.938、1.172、0.294、0.148、0.112 mg·mL-1的混合对照品贮备液。精密吸取该贮备液2.5 mL，用甲醇稀释定容至50 mL，得白术内酯Ⅱ23.7 μg·mL-1、苍术素52.8 μg·mL-1、柚皮芸香苷46.9 μg·mL-1、橙皮苷58.6 μg·mL-1、川陈皮素14.7 μg·mL-1、橘红素7.4 μg·mL-1、广藿香酮5.6 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液及阴性样品溶液的制备

精密量取神术合剂1.0mL，置25mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，0.45μm 微孔滤膜过滤，即得。

按神术合剂处方分别制备缺苍术、缺陈皮、缺广藿香的阴性样品，按上述方法制备阴性样品溶液。

2.4 系统适用性要求

精取“2.2”项下混合对照品溶液和“2.3”项下各溶液适量，按“2.1”色谱条件进样检测，记录色谱图（见图1）。结果显示，在供试品溶液中7 个目标成分在对照品色谱峰相同保留时间处有相应的色谱峰，与相邻色谱峰的分离度均＞1.5；理论塔板数按广藿香酮等7 个活性成分的色谱峰计不得低于3500，阴性样品对神术合剂中7 个目标成分的测定无干扰。

图1 混合对照品（A）、神术合剂供试品（B）、苍术阴性样品（C）、陈皮阴性样品（D）、广藿香阴性样品（E）HPLC 色谱图

2.5 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下混合对照品贮备液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别用甲醇稀释定容至20 mL，制备系列质量浓度混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测白术内酯Ⅱ、苍术素、柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素、广藿香酮的峰面积，以各成分质量浓度为X（μg·mL-1），相应的峰面积为Y进行线性回归，结果见表1。

表1 7 个目标化合物回归方程、线性范围及相关系数

2.6 进样精密度试验

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液10 μL，按“2.1”色谱条件重复进样6 次，测得白术内酯Ⅱ、苍术素、柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素、广藿香酮峰面积的RSD（n=6）分别为0.93%、0.66%、0.80%、0.57%、0.99%、1.08%、1.14%。

2.7 重复性试验

取批号200414 神术合剂样品适量，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.1”色谱条件进样检测，计算白术内酯Ⅱ、苍术素、柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素、广藿香酮含量的RSD（n=6）分别为1.54%、0.89%、1.35%、0.77%、1.49%、1.76%、1.83%。

2.8 稳定性试验

精密吸取神术合剂同一份供试品溶液适量，按“2.1”色谱条件分别于0、2、4、8、16、24 h 进样检测7个成分的峰面积，结果供试品溶液24 h 内稳定，白术内酯Ⅱ、苍术素、柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素、广藿香酮峰面积的RSD（n=6）分别为1.08%、0.82%、1.05%、0.91%、1.15%、1.30%、1.21%。

2.9 加样回收率试验

精密量取已知7 个成分的神术合剂0.5mL，共9份，分别按已知含量的50%、100%、150%三个水平精密加入混合对照品溶液（白术内酯Ⅱ0.129mg·mL-1、苍术素0.287 mg·mL-1、柚皮芸香苷0.242 mg·mL-1、橙皮苷0.329 mg·mL-1、川陈皮素0.087 mg·mL-1、橘红素0.039mg·mL-1、广藿香酮0.028mg·mL-1）1.0、2.0、3.0mL各3 份，按“2.3”项下方法制备加样供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，结果所测成分的平均加样回收率（RSD，n=9）分别为98.45%（1.29%）、100.05%（0.68%）、98.58%（1.80%）、99.05%（1.54%）、97.60%（1.51%）、96.98%（0.88%）、97.31%（1.03%）。

2.10 相对校正因子（RCF）的测定

精密吸取“2.5”项下6 种质量浓度的混合对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样检测白术内酯Ⅱ、苍术素、柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素、广藿香酮的峰面积，以橙皮苷为内参物，按照RCF 计算公式：RCFks=（式中Ak为内参物橙皮苷峰面积，Ws为其他成分质量浓度，As为其他成分的峰面积，Wk为内参物橙皮苷质量浓度）分别计算白

术内酯Ⅱ等6 个成分的RCF，结果见表2。

表2 以橙皮苷为内参物的6 种成分的RCF

2.11 RCF 耐用性考察

2.1 1.1 不同柱温精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测白术内酯Ⅱ等6 个成分的峰面积，考察不同柱温（20℃、22℃、25℃、28℃、30℃）对RCF 的影响，结果以均值（范围）计，即RCF 分别为0.823 9、1.136 2、1.343 7、0.657 1、0.704 8、1.671 2，RSD 分别为0.97%、1.52%、1.01%、1.87%、1.19%、1.65%。

2.1 1.2 不同仪器、色谱柱精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测白术内酯Ⅱ、苍术素、柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素、广藿香酮的峰面积，考察Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪、LC-20AT 型高效液相色谱仪和液相色谱柱Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Ultimate XB-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）对RCF 的影响，上述化合物RCF 值得RSD 分别为0.73%、1.87%、1.39%、1.58%、0.84%、1.15%。

2.1 1.3 不同流动相流速精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测白术内酯Ⅱ等6 个成分的峰面积，考察不同流速（0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL·min-1）对各RCF 的影响，其RSD 分别为0.54%、1.40%、1.28%、1.89%、1.26%、0.98。

2.12 待测组分色谱峰的定位

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录白术内酯Ⅱ、苍术素、柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素、广藿香酮色谱峰的保留时间，考察“2.11.2”所述2 个色谱仪和3 个色谱柱对相对保留时间值的影响，上述化合物其RSD分别为1.31%、1.76%、0.74%、1.13%、0.92%、0.27%。

2.13 一测多评法（QAMS）与外标法（ESM）测定结果比较

取神术合剂样品3 批，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测白术内酯Ⅱ、苍术素、柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素、广藿香酮的峰面积，分别采用外标法和一测多评法计算上述成分的含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（mg·mL-1，n=3）

3 讨论

本实验参考中药质量标志物确认原则，采用一测多评法测定神术合剂中的7 个成分，为神术合剂的质量可控性提供有力的实验数据。

本方法在流动相选择中，首先对等度流动相甲醇-水系统[9,10]、乙腈-水系统[11]进行了考察，发现甲醇-水系统出现基线严重漂移，干扰检测；乙腈-水系统相对稳定，但陈皮所含成分橙皮苷含量较高，出现色谱峰变形，与川陈皮素色谱峰不能完全分离，同时检测用时较长；考虑加入0.1%磷酸溶液[8]、0.1%冰醋酸溶液[11]和0.1%甲酸溶液[7]，经过大量试验，最终采用乙腈-0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱，实现了神术合剂中7 个化合物的同时分离分析，色谱分离基线平稳，各成分色谱峰峰形对称，分离度良好。

本研究采用一测多评法对神术合剂中广藿香酮等7 个成分含量进行测定，该方法操作便捷，结果准确，重复性好，有助于进一步提高、完善神术合剂的质量标准，确保产品质量稳定性和临床治疗效果的一致性。