新型苯并吗啉-8-甲酰胺衍生物的合成及抗肿瘤活性

奉 强, 常 波, 何华龙, 雷 侠, 李倩意,朱建豪, 燕 艳, 余洛汀*, 张小玲*

(1. 成都师范学院 化学与生命科学学院 功能分子结构优化与应用四川省高校重点实验室，四川 成都 611130;2. 四川大学 生物治疗国家重点实验室，四川 成都 610041)

恶性肿瘤是全球最严重的健康问题之一。近年来，淋巴瘤和肺癌发病率在我国增长尤为迅猛[1]。相较肿瘤三大传统治疗手段，靶向表观遗传调节子提供了一种全新的癌症治疗策略。组蛋白赖氨酸甲基转移酶家族成员Zeste同源增强子2(EZH2)在淋巴瘤和肺癌等多种血液瘤和实体瘤中过表达，其表达量与肿瘤组织类型、分化程度、临床分期和不良预后密切相关。持续激活的EZH2酶高表达与多种肿瘤有关，失调的EZH2及其介导的通路成为当前肿瘤治疗研究的热门靶点[2-9]。

为了寻找结构新颖的EZH2小分子抑制剂，本课题组设计并合成了一系列以苯环、吲唑环和苯并吗啉环为骨架结构的新型EZH2抑制剂(Chart 1)。通过生物实验评价所合成化合物抑制活性及探究其构效关系，发现多个化合物在低微摩尔浓度水平对肺癌细胞A549、H1975具有抑制活性的EZH2小分子抑制剂。基于前期获得的EZH2抑制剂6y的苯并吗啉骨架结构，设计在苯并吗啉骨架氮原子上引入芳基磺酰基，合成系列化合物并探究其抗肿瘤活性。

以6-溴N-(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲基)苯并吗啉-8-甲酰胺(1)为原料，在三乙胺作用下与芳基磺酰氯反应得到6-溴N-(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲基)-4-芳磺酰基苯并吗啉-8-甲酰胺(2a～2b)；2分别与芳基频呐醇硼酸酯偶联反应，得到一系列新型的6-芳基/烯基N-(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲基)-4-芳磺酰基苯并吗啉-8-甲酰胺衍生物(3a～3q, Scheme 1)，其结构经1H NMR、13C NMR和MS(EI)表征。应用Alpha LISA方法测试所合成化合物对EZH2的体外酶抑制活性；采用MTT法测定化合物对非小细胞肺癌细胞A549和人类B细胞淋巴瘤细胞SU-DHL-4的细胞增殖抑制作用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker 400 MHz型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标); Spectra Max M 2型全波长酶标仪; DSQ型质谱仪(EI源)。

磺酰氯，分析纯，上海毕得医药有限公司；硼酸酯，分析纯，阿拉丁试剂公司；EZH2酶(WT)， Biogenie公司；四氮唑蓝(MTT)， Sigma公司；384孔检测板和磁珠购自Perkin Elmer公司；化合物6y和6-溴-N-(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-)甲基苯并吗啉-8-甲酰胺为实验室自制；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1)2a～2b的合成通法

氮气氛围下，向500 mL三颈瓶中加入6-溴-N-(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-)甲基苯并吗啉-8-甲酰胺19.6 g(50 mmol)，三乙胺17.5 mL(125 mmol)，干燥二氯甲烷250 mL，搅拌下于冰盐浴中冷至0～5℃，慢慢滴加溶有芳基磺酰氯(60 mmol)的二氯甲烷溶液50 mL。滴毕，撤去冰盐浴自然升温至室温搅拌反应过夜。TLC监测反应完全，蒸除溶剂，剩余物用二氯甲烷/水萃取，萃取液经水洗、1mol/L稀盐酸洗涤，水洗、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸干得白色固体物220.7～22.3 g，收率78%～81%。产物无须纯化，直接用于下一步反应。

(2)3a～3q的合成通法

氮气保护，在50 mL单颈瓶中加入二氧六环21 mL，搅拌下加入化合物2(1.5 mmol)，芳基硼酸频哪醇酯(2 mmol)，无水磷酸钠0.85 g(4 mmol)，水3 mL，抽真空,用氮气置换5次，加入催化剂[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯30 mg(0.041 mmol)，抽真空，用氮气置换5次，快速升温至回流，反应5 h(TLC和HPLC监测)。冰盐浴冷却至0 ℃，抽滤，滤饼加入10 mL水，洗涤10 min；抽滤，滤饼再次用10 mL水洗涤，过滤，滤饼经硅胶柱层析[洗脱剂：V(二氯甲烷)/V(甲醇)=20/1]纯化得白色或淡灰色固体3a～3q。

3a: 白色固体408 mg，收率51%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 10.79(s, 1H), 8.40(t,J=5.9 Hz, 1H), 8.11～7.99(m, 2H), 7.76(s, 1H), 7.64(m, 3H), 7.57(m, 1H), 7.46(t,J=7.7 Hz, 2H), 5.90(s, 1H), 4.49(d,J=5.9 Hz, 2H), 3.93(s, 3H), 3.90(d,J=4.3 Hz, 2H), 3.88(d,J=4.2 Hz, 2H), 2.39(s, 3H), 2.19(s, 3H);13C NMR(101 MHz,Chloroform-d)δ: 165.07, 164.21, 150.64, 145.30, 145.04, 141.61, 137.54, 132.31, 130.36, 130.09, 128.71, 127.87, 127.24, 127.17, 124.40, 122.67, 122.15, 120.34, 109.64, 76.28, 63.19, 43.86, 41.57, 19.28, 18.88； MS(EI)m/z: 534.2{[M+H]+}。

Chart 1

Scheme 1

3b: 白色固体330 mg，收率46%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 10.95(s, 1H), 8.34(s, 1H), 7.96(m, 1H), 7.61(m, 2H), 7.45(td,J=7.8 Hz, 2.7 Hz, 1H), 7.23(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.01(t,J=8.0 Hz, 1H), 6.66(dd,J=17.6 Hz, 10.9 Hz, 1H), 5.90(s, 1H), 5.74(d,J=17.6 Hz, 1H), 5.24(d,J=10.9 Hz, 1H), 4.48(d,J=6.0 Hz, 2H), 3.88(t,J=2.4 Hz, 4H), 2.38(s, 3H), 2.19(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 164.84, 163.37, 155.02, 145.56, 144.96, 142.50, 131.96, 130.37, 128.61, 127.94, 127.54, 127.50, 126.25, 124.19, 122.70, 122.44, 120.94, 109.70, 77.22, 43.61, 35.83, 19.65, 18.84; MS(EI)m/z: 480.2{[M+H]+}。

3c: 白色固体556 mg，收率63%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 11.53(s, 1H), 8.35(t,J=5.9 Hz, 1H), 8.18(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.92(m, 1H), 7.60(m, 2H), 7.46(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.01(m, 1H), 6.74(d,J=2.2 Hz, 2H), 6.45(m, 1H), 5.91(s, 1H), 4.51(d,J=6.1 Hz, 2H), 3.91(m, 4H), 3.84(s, 6H), 2.38(s, 3H), 2.19(s, 3H)；13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 165.00, 161.11, 150.62, 144.61 , 142.20, 141.52, 138.49, 134.98, 129.54, 128.97, 127.90, 127.27, 126.18, 124.43, 122.75, 122.49, 120.70, 109.76, 104.99, 99.66 , 63.67, 55.47, 43.59 , 35.86, 19.66 , 18.73； MS(EI)m/z: 590.2{[M+H]+}。

3d: 白色固体469 mg，收率59%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 10.99(s, 1H), 8.60(m, 2H), 8.34(t,J=5.9 Hz, 1H), 8.21(m, 2H), 7.67(m, 2H), 7.62(m, 1H), 7.54(m, 2H), 7.44(t,J=7.7 Hz, 2H), 7.36(m, 1H), 5.91(s, 1H), 4.50(d,J=5.9 Hz, 2H), 3.97(s, 4H), 2.38(s, 3H), 2.21(s, 3H)；13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 164.71, 151.04, 144.31, 142.40, 142.29, 137.54, 133.77, 131.05, 129.46, 129.21, 129.08, 128.94, 127.93, 127.65, 127.27, 127.01, 124.34, 122.63, 122.21, 109.84, 77.01, 63.97, 43.14, 19.21, 18.74； MS(EI)m/z: 530.2 {[M+H]+}。

3e: 白色固体394 mg，收率48%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 10.77(s, 1H), 8.33(t,J=5.8 Hz, 1H), 7.93(dd,J=7.9 Hz, 1.7 Hz, 1H), 7.62(d,J=10.1 Hz, 2H), 7.47(d,J=10.1 Hz, 2H), 7.13(s, 1H), 7.01(t,J=8.0 Hz, 1H), 5.89(d,J=3.7 Hz, 1H), 4.48(m, 2H), 3.90(s, 4H), 3.63(s, 3H), 2.41(s, 3H), 2.36(s, 3H), 2.19(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 165.25, 164.30, 163.22, 157.82, 151.67, 148.00, 144.32, 142.99, 137.25, 133.01, 129.86, 129.33, 128.97, 127.75, 127.03, 124.06, 122.55, 121.16, 109.23, 77.34, 63.21, 43.08, 43.42, 37.22, 19.67, 18.78; MS(EI)m/z: 549.2{[M+H]+}。

3f: 白色固体377 mg，收率46%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 11.35(s, 1H), 8.30(t,J=5.9 Hz, 1H), 8.08(d,J=2.5 Hz, 1H), 8.02(d,J=2.5 Hz, 1H), 7.92(td,J=8.1 Hz, 1.7 Hz, 2H), 7.62(m, 3H), 7.47(dt,J=15.3 Hz, 7.7 Hz, 2H), 7.01(t,J=8.0 Hz, 1H), 5.90(s, 1H), 4.48(d,J=6.2 Hz, 2H), 3.87(d,J=5.0 Hz, 4H), 2.36(s, 3H), 2.19(s, 3H), 1.79(s, 2H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 164.95, 164.36, 150.55, 145.13, 144.11, 142.18, 142.09, 138.50, 133.54, 131.48, 129.64, 129.49, 128.99, 127.90, 127.25, 127.19, 124.16, 122.70, 122.59, 120.71, 109.69, 77.23, 63.59, 43.60, 19.64, 18.76; MS(EI)m/z: 548.2{[M+H]+}。

3g: 白色固体620 mg，收率72%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 11.43(s, 1H), 8.11(t,J=5.9 Hz, 1H), 7.97(dd,J=8.2 Hz, 1.7 Hz, 1H), 7.84(dd,J=7.9 Hz, 1.7 Hz, 1H), 7.57(m, 2H), 7.46(m, 1H), 7.28(m, 2H), 7.22(m, 1H), 7.03(t,J=8.0 Hz, 1H), 6.84(d,J=8.5 Hz, 1H), 5.97(s, 2H), 5.68(s, 1H), 4.49(d,J=6.0 Hz, 2H), 3.84(s, 4H), 2.38(s, 3H), 2.17(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 165.07 , 161.31, 151.02, 147.97, 144.67, 142.24, 141.53, 138.57, 134.44, 133.60, 129.51, 128.97, 127.91, 127.31, 126.17, 124.34, 122.61, 122.47, 120.77, 109.68, 104.95, 102.37, 99.69, 63.24, 43.58, 35.86, 19.45, 18.88; MS(EI)m/z: 574.2{[M+H]+}。

3h: 白色固体616 mg，收率64%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 11.45(s, 1H), 8.35(t,J=5.9 Hz, 1H), 8.20(q,J=2.4 Hz, 2H), 7.66(m, 2H), 7.58(m, 3H), 7.46(t,J=7.8 Hz, 2H), 7.37(d,J=8.0 Hz, 2H), 5.90(s, 1H), 4.51(d,J=5.9 Hz, 2H), 3.90(hept,J=2.9 Hz, 2.2 Hz, 4H), 3.54(s, 2H), 2.49(s, 8H), 2.38(s, 3H), 2.30(s, 3H), 2.18(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 165.91, 161.67, 150.22, 144.19, 142.45, 141.25, 138.67, 134.53, 129.46, 128.67, 127.88, 127.21, 126.29, 124.53, 122.57, 122.34, 121.04, 109.14, 104.61, 99.36, 65.34, 63.87, 55.41, 54.24, 45.56, 43.61, 35.82, 19.64, 18.77; MS(EI)m/z: 642.3{[M+H]+}。

3i: 白色固体381 mg，收率47%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 11.09(s, 1H), 8.69～8.59(m, 2H), 8.41(t,J=5.9 Hz, 1H), 8.28(m, 2H), 7.67(m, 2H), 7.61(m, 1H), 7.55(m, 2H), 7.48(t,J=7.7 Hz, 2H), 5.91(s, 1H), 4.51(d,J=5.9 Hz, 2H), 3.93(s, 4H), 2.39(s, 3H), 2.20(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 164.88, 164.23, 146.27, 144.33, 142.48, 142.29, 138.57, 133.86, 131.55, 129.70, 129.46, 128.99, 127.93, 127.22, 127.10, 124.54, 122.60, 122.38, 109.48, 77.32, 63.79, 43.40, 19.62, 18.67; MS(EI)m/z: 545.2{[M+H]+}。

3j: 白色固体520 mg，收率53%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 10.33(s, 1H), 8.41(t,J=5.9 Hz, 1H), 8.21(s, 2H), 7.58(d,J=7.9 Hz, 2H), 7.53(d,J=8.1 Hz, 2H), 7.37(d,J=7.9 Hz, 2H), 7.24(d,J=8.4 Hz, 2H), 5.89(s, 1H), 4.50(d,J=5.9 Hz, 2H), 3.92(s, 4H), 3.55(s, 2H), 2.52(s, 8H), 2.40(s, 3H), 2.39(s, 3H), 2.32(s, 3H), 2.19(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 165.87, 161.52, 151.24, 144.37, 143.51, 141.23, 138.96, 134.84, 129.31, 128.88, 127.77, 127.15, 126.83, 124.62, 122.87, 122.44, 121.58, 109.67, 104.49, 99.61, 65.44, 63.79, 55.97, 54.11, 45.36, 43.59, 35.04, 22.17, 19.44, 18.67; MS(EI)m/z: 656.3{[M+H]+}。

3k: 白色固体mg，收率%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 11.24(s, 1H), 8.30(t,J=5.8 Hz, 1H), 7.90(dd,J=7.9, 1.7 Hz, 1H), 7.49(d,J=10.1 Hz, 2H), 7.25(d,J=10.1 Hz, 2H), 7.08(s, 1H), 5.91(d,J=3.7 Hz, 1H), 4.48(m, 2H), 3.93(s, 4H), 3.77(s, 3H), 3.68(s, 3H), 2.39(s, 3H), 2.37(s, 3H), 2.19(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 164.95, 164.36, 163.02, 158.64, 150.55, 145.13, 142.09, 138.50, 133.54, 129.64, 129.49, 128.99, 127.90, 127.19, 124.16, 122.70, 120.71, 109.69, 77.24, 63.59, 43.60, 43.72, 36.01, 35.81, 19.64, 18.76; MS(EI)m/z: 563.2{[M+H]+}。

3l: 白色固体346 mg，收率47%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 11.30(s, 1H), 8.30(t,J=5.7 Hz, 1H), 7.94(m, 1H), 7.50(dd,J=7.9 Hz, 5.3 Hz, 2H), 7.23(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.00(t,J=8.0 Hz, 1H), 6.65(dd,J=17.6 Hz, 10.9 Hz, 1H), 5.90(s, 1H), 5.73(d,J=17.6 Hz, 1H), 5.23(d,J=10.9 Hz, 1H), 4.49(d,J=5.9 Hz, 2H), 3.87(s, 4H), 2.39(s, 3H), 2.37(s, 3H), 2.19(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 165.04, 164.43, 150.62, 145.11, 144.57, 142.22, 135.49, 130.11, 128.83, 127.91, 127.27, 127.21, 126.70, 124.26, 122.66, 122.52, 120.65, 109.72, 77.25, 43.58, 35.79, 21.59, 19.64, 18.71; MS(EI)m/z: 494.2{[M+H]+}。

3m: 白色固体451 mg，收率55%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 10.87(s, 1H), 8.37～8.25(m, 1H), 8.09(d,J=2.5 Hz, 1H), 8.01(d,J=2.6 Hz, 1H), 7.92(m, 1H), 7.52(m, 2H), 7.23(m, 2H), 7.00(t,J=8.0 Hz, 1H), 5.90(d,J=1.7 Hz, 1H), 4.48(d,J=5.9 Hz, 2H), 3.88(s, 4H), 2.40(s, 3H), 2.36(s,3H), 2.24(s, 3H), 2.19(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 165.00, 164.12, 150.51, 145.34, 144.55, 141.87, 137.68, 135.54, 130.10, 130.07, 128.67, 127.81, 127.21, 127.07, 124.61, 122.97, 122.34, 120.60, 109.47, 76.63, 63.24, 43.78, 41.30, 20.32, 19.04, 18.87; MS(EI)m/z: 548.2{[M+H]+}。

3n: 白色固体580 mg，收率66%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 11.56(s, 1H), 8.28(t,J=5.9 Hz, 1H), 7.93(dd,J=8.2 Hz, 1.7 Hz, 1H), 7.90(dd,J=7.9 Hz, 1.7 Hz, 1H), 7.50(m, 2H), 7.24(m, 2H), 7.08(m, 1H), 7.00(t,J=8.0 Hz, 1H), 6.85(d,J=8.5 Hz, 1H), 5.99(s, 2H), 5.91(s, 1H), 4.49(d,J=6.0 Hz, 2H), 3.87(s, 4H), 2.39(s, 3H), 2.37(s, 3H), 2.19(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 165.23, 161.17, 150.41, 147.46, 144.50, 142.16, 141.57, 138.49, 134.34, 133.67, 129.27, 128.86, 127.89, 127.20, 126.38, 124.09, 122.34, 122.07, 120.61, 109.34, 104.27, 102.21, 99.17, 63.57, 42.36, 35.60, 23.44, 19.37, 18.91; MS(EI)m/z: 588.2{[M+H]+}。

3o: 白色固体352 mg，收率44%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 10.90(s, 1H), 8.32(d,J=6.6 Hz, 1H), 7.92(m, 2H), 7.84(dd,J=14.3 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.50(t,J=8.4 Hz, 3H), 7.24(m, 2H), 7.00(t,J=8.0 Hz, 1H), 5.90(d,J=3.8 Hz, 1H), 4.49(t,J=6.2 Hz, 2H), 3.88(s, 4H), 2.39(s, 3H), 2.37(s, 3H), 2.20(d,J=3.7 Hz, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 165.50 , 164.44 , 150.58 , 145.14 , 144.57 , 141.98, 135.50, 130.26, 130.11, 128.87, 127.96, 127.22, 127.15, 124.27, 122.91, 122.64, 120.65, 109.66, 76.82, 63.55, 43.59, 21.60, 19.66, 18.79; MS(EI)m/z: 534.2{[M+H]+}。

3p: 白色固体430 mg，收率53%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 11.17(s, 1H), 8.65(d,J=5.2 Hz, 2H), 8.40(t,J=5.9 Hz, 1H), 8.28(m, 2H), 7.54(m, 4H), 7.26(d,J=6.6 Hz, 2H), 5.92(s, 1H), 4.52(d,J=5.9 Hz, 2H), 3.92(q,J=4.1 Hz, 3.6 Hz, 4H), 2.40(s, 3H), 2.39(s, 3H), 2.20(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 164.93, 164.22, 146.37, 144.21, 142.26, 142.20, 135.88, 133.77, 131.43, 130.27, 129.56, 128.91, 128.62, 127.80, 127.13, 127.02, 124.45, 122.26, 109.45, 77.30, 63.73, 43.24, 35.06, 19.54, 18.74; MS(EI)m/z: 545.2{[M+H]+}。

3q: 白色固体606 mg，收率67%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 11.08(s, 1H), 8.27(t,J=5.9 Hz, 1H), 8.12(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.92(m, 1H), 7.54(m, 2H), 7.39(d,J=8.0 Hz, 2H), 6.70(d,J=2.2 Hz, 2H), 6.44(m, 1H), 5.90(s, 1H), 4.53(d,J=6.1 Hz, 2H), 3.88(m, 4H), 3.82(s, 6H), 2.46(s, 3H), 2.37(s, 3H), 2.19(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 165.21, 161.19, 150.43, 144.55, 142.12, 141.52, 138.43, 133.67, 129.41, 128.90, 127.87, 127.24, 126.38, 124.00, 122.57 , 122.11, 120.63, 109.84, 104.67, 99.03, 63.51, 55.23, 42.51, 35.68, 23.54, 19.61, 18.87; MS(EI)m/z: 604.2{[M+H]+}。

1.3 化合物对WT的抑制活性及其体外抗肿瘤活性测试

采用AlphaLISA筛选方法对化合物进行EZH2(WT)酶活性检测。将化合物储备液(10 mM)用DMSO稀释到1 μmol·L-1浓度。分别取100 μL的体积加入到384孔检测板中，每个药物浓度设置3个复孔。分别加入5 μL的EZH2酶溶液，1000 r·min-1离心1 min，室温孵育15 min。加入5 μL所合成化合物，1000 r·min-1离心1 min，室温孵育1 h。加入5 μL受体磁珠终止酶反应，1000 r·min-1离心1 min，室温孵育1 h。避光条件下加入10 μL供体磁珠，1000 r·min-1离心1 min，室温孵育30 min，采用EnSpire的Alpha模式检测信号强度。计算化合物对EZH2酶抑制活性。其中，阳性对照物选用本课题组前期已报道的EZH2小分子抑制剂6y。

采用MTT法测试化合物3a～3q对非小细胞肺癌细胞A549和人类B细胞淋巴瘤细胞SU-DHL-4的细胞增殖抑制作用。收集传代培养中处于对数生长期的细胞，用培养基混合均匀，计数，然后向96孔板的每个孔内加入100 μL混悬液，保证每孔接种2000个细胞；将96孔板置于37 ℃、 5%CO2孵箱中，培养24 h；将化合物储备液(10 mM溶于DMSO)用培养基稀释成不同浓度，采用三倍稀释法。按每孔100 μL的体积加入96孔板中，最高浓度为30 μM,最低浓度为0.33 μM，每个药物浓度设置3个复孔，并用含0.1%DMSO培养基和纯培养基处理细胞作为阴性对照，加完药物后继续将96孔板置于37 ℃、 5%CO2孵箱中，培养一定时间；每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)后，在孵箱中继续培养2～4 h后终止培养。小心吸弃上清液；每孔加入150 μL 二甲亚砜溶剂，在摇床上轻摇10 min，使蓝色结晶物充分溶解；选择设定波长为570 nm，利用酶标仪测定每孔的光吸收值，记录结果。实验重复3次以上，计算平均值和标准差。半效抑制浓度(IC50)根据相对细胞增殖抑制率和药物浓度由统计学软件SPSS计算得出。

2 结果与讨论

2.1 合成

(1)1的合成

参考6y的合成方法，以水杨酸为起始原料，经酯化、溴代、硝化、还原、环化、水解以及酰胺化反应，顺利得到6y。反应从克级到十克级均很稳定，7步反应总收率可达30%。

(2)2的合成

由化合物1与苯磺酰氯或对甲苯磺酰氯反应，以氯代烃二氯甲烷、三氯甲烷或1,2-二氯乙烷作溶剂，有机碱三乙胺、二异丙基乙基胺或吡啶为碱，反应均能顺利进行且以80%左右收率得到N-磺酰化产物2a～2b。

(3)3的合成

3的合成反应属于经典的Suzuki偶联反应，选用常规反应条件：1 mmol的2、 1.1 mmol的频呐醇硼酸酯、2 mmol无机碱、5mol%钯催化剂、二氧六环和水的混合溶剂(体积比为7/1)，氮气氛围下回流反应。尝试多种无机碱和多种钯催化剂，实验发现无水磷酸钠2 mmol与[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯0.2mol%的组合催化效果最好。回流反应3 h，以40%～70%的收率得到目标化合物3a～3q。

2.2 体外抗癌活性

采用AlphaLISA法测试3a～3q对EZH2(WT)酶抑制活性和MTT法测试化合物对非小细胞肺癌细胞A549和人类B细胞淋巴瘤细胞SU-DHL-4的细胞增殖抑制作用，结果见表1。 由表1可知，当苯并吗啉6-位取代基为苯基和氨基吡啶基时，3d和3f对EZH2有一定抑制活性，浓度为1 μM时对EZH2抑制率分别为38%和33%；当6-位取代基为吡唑基和3,5-二甲氧基苯基时，3o和3q对EZH2抑制抑制作用增强，抑制率分别为47%和52%; 活性与对照物6y相当；当6-位取代基为呱啶甲基苯基时，3h和3j对EZH2抑制作用较强，尤其是3j，浓度为1 μM时对EZH2抑制率达到68%，但活性不如对照物6y。

测试化合物3a～3q对A549细胞和SU-DHL-4细胞增殖抑制作用发现，化合物对SU-DHL-4细胞增殖抑制活性都比对A549细胞增殖抑制活性好，尤其是化合物3h和3j，对SU-DHL-4细胞增殖抑制活性IC50分别达到4.48和2.82 μM，接近对照物6y对SU-DHL-4细胞增殖抑制活性(IC50=1.3 μM)。

表1 化合物对EZH2酶的抑制活性及其体外抗肿瘤活性

合成了17个以N-磺酰基取代的苯并吗啉为母核的小分子EZH2抑制剂，母核6-位取代基包括苯基、3,5-二甲氧基苯基、吡唑基、吡啶基和氨基吡啶基等。通过抗肿瘤活性测试最终得到化合物3h和3j，在浓度为1 μM时，对EZH2抑制率最高分别达到46%和68%;虽然抗肿瘤生物活性差于前期得到的抑制剂6y，但3h和3j对SU-DHL-4细胞增殖半数抑制浓度分别达到4.48和2.82 μM，接近对照物6y。