新型含硫吡唑杂环的合成及其抗稻瘟病菌活性研究

李明桦, 董守诚, 谢金鑫, 邓志鹏, 汤日元

(华南农业大学 材料与能源学院，广东 广州 510642)

水稻是世界上近一半人口的主要粮食作物。然而，当前全球水稻每年因稻瘟病危害而导致的减产幅度高达10%～30%，极端情况下甚至绝收[1-2]。稻瘟病是水稻种植业中最具破坏性的疾病之一，而稻瘟病菌(MagnaportheGrisea)则是造成稻瘟病的典型病因[3-4]。

吡唑骨架上有多个不同化学环境的取代位点，可改变吡唑环活性基团的取代位置和种类[5]。在吡唑上进行多样性衍生可获得生理活性不同的吡唑衍生物，使其在农药和医药领域有广泛的应用，如作为蛋白糖基化抑制剂[6]、抗菌[7]、抗癌[8]、抗氧化剂[9]和抗病毒药物[10]等。尤其是在农业方面，吡唑类农药具有广谱、高效、低毒、作用机理独特、安全等特点，已成为新农药创制研究中的焦点之一[11]。

Scheme 1

Scheme 2

本文通过底物设计，改变吡唑环活性取代基的种类和取代位置，以达到改变和丰富吡唑农药生物活性的目的。通过5-氨基吡唑与便宜易得的秋兰姆反应合成吡唑二硫代氨基甲酸酯衍生物(Scheme 1)，含氰基吡唑与秋兰姆作为硫化试剂反应合成吡唑硫代酰胺及其衍生物(Scheme 2)，以及以氟虫腈中间体为底物利用硫化、环化和氧化反应制备相应的衍生物(Scheme 3)。通过这3条路径合成了14种含硫吡唑杂环衍生物，其结构经1H NMR,13C NMR和MS(ESI)表征。其中，化合物3j，4j和5j为新化合物。采用生长速率法，在100 mg·L-1浓度下，对化合物的稻瘟病菌(MagnaportheGrisea)抑制活性进行了初步测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

JH-30型熔点仪(温度未校正)；Bruker-600 MHz/500 MHz型核磁共振仪(CDCl3或DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；API 3200型液相色谱串联质谱联用仪(ESI源)。

2j(黄色粉状固体，收率95%)按文献[12]方法合成；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 吡唑-二硫代氨基甲酸酯(3a～3e)的合成(以3a为例)[13]

向反应管中依次加入1a0.0346 g(0.2 mmol)，2a0.0721 g(0.15 mmol)，碘化钾0.0066 g(0.02 mmol)，过硫酸钾0.1081 g(0.2 mmol)和DMF/H2O(2 mL,V/V=5/1)，搅拌下于60 ℃反应24 h。冷却至室温，依次用CH2Cl2(3×150 mL)和饱和食盐水(3×150 mL)萃取，合并有机相，抽滤，滤饼用无水Na2SO4干燥，蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂： 乙酸乙酯/石油醚=1/1，V/V)纯化得3a。

Scheme 3

3a： 白色固体，收率86%, m.p.177.6～178.3 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.72～7.69(m, 2H, Ph-H), 7.35(t,J=7.4 Hz, 2H, Ph-H), 7.32～7.29(m, 1H, Ph-H), 3.95(s, 2H, NH2), 3.75(s, 3H, Me), 3.55(s, 3H, Me), 3.47(s, 3H, Me);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 197.1, 152.5, 150.0, 132.8, 128.1, 127.9, 127.9, 88.3, 46.11, 41.64, 35.15; MS(ESI)m/z: 293.1{[M+H]+}, 315.3{[M+Na]+}。

3b： 黄色固体，收率61%, m.p.112.3～115.4 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.69(d,J=7.1 Hz, 2H, Ph-H), 7.34(t,J=7.3 Hz, 2H, Ph-H), 7.32～7.28(m, 1H, Ph-H), 4.03(q,J=7.1 Hz, 2H, CH2), 3.97(s, 2H, NH2), 3.85(q,J=7.1 Hz, 2H, CH2), 3.77(s, 3H, Me), 1.36(t,J=7.1 Hz, 3H, Me), 1.29(t,J=7.1 Hz, 3H, Me);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 195.6, 152.5, 150.3, 132.9, 128.1, 127.9, 127.9, 88.5, 50.4, 46.9, 35.2, 13.0, 11.7; MS(ESI)m/z: 321.3{[M+H]+}, 343.4{[M+Na]+}。

3c： 白色固体，收率71%, m.p.178.8～180.2 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.56(d,J=7.6 Hz, 2H, Ph-H), 7.45(t,J=7.9 Hz, 2H, Ph-H), 7.32(t,J=7.4 Hz, 1H, Ph-H), 4.17(s, 2H, NH2), 3.54(s, 3H, Me), 3.51(s, 3H, Me), 2.17(s, 3H, Me);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 196.8, 153.0, 149.1, 129.4, 127.3, 123.6, 89.5, 46.0, 41.57, 12.3; MS(ESI)m/z: 292.9{[M+H]+}, 315.4{[M+Na]+}。

3d： 白色固体，收率63%, m.p.78.8～79.7 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.82～7.79(m, 2H, Ph-H), 7.68(d,J=7.6 Hz, 2H, Ph-H), 7.51(t,J=7.9 Hz, 2H, Ph-H), 7.41～7.37(m, 3H, Ph-H), 7.35～7.32(m, 1H, Ph-H), 4.26(s, 2H, NH2), 3.56(s, 3H, Me), 3.49(s, 3H, Me);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 196.5, 150.1, 138.4, 132.6, 129.5, 128.1, 128.1, 128.1, 127.8, 124.0, 46.1, 41.7; MS(ESI)m/z: 355.3{[M+H]+}, 377.4{[M+Na]+}。

3e： 白色固体，收率60%, m.p.152.0～153.6 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.46(d,J=8.3 Hz, 2H, Ar-H), 7.26(d,J=8.0 Hz, 2H, Ar-H), 4.05(s, 2H, NH2), 3.56(s, 3H, Me), 3.53(s, 3H, Me), 2.38(s, 3H, Me), 1.36(s, 9H, Me);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 196.7, 161.6, 150.2, 137.3, 130.0, 123.9, 87.1, 46.1, 41.6, 33.4, 29.4, 21.1; MS(ESI)m/z: 349.3{[M+H]+}, 371.3{[M+Na]+}。

在对厦门市实施可持续发展策略的过程中，首先应通过资源调查确定厦门市旅游资源的承载力以及资源的自身优势，进而保障可持续发展策略的实施。[1]

(2) 吡唑硫代酰胺衍生物和吡唑噻唑衍生物的合成(以2f,3f为例)[14]

向反应管中依次加入1f0.0286 g(0.2 mmol)，二硫化四甲基秋兰姆0.0721 g(0.3 mmol)，碘化钾0.0066 g(0.02 mmol)，过硫酸钾0.2162 g(0.4 mmol)和DMF/H2O(2 mL，V/V=5/1)，搅拌下于120 ℃反应12 h。冷却至室温，依次用CH2Cl2(3×150 mL)和饱和食盐水(3×150 mL)萃取，合并有机相，抽滤，滤饼经无水Na2SO4干燥，蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚=1/2，V/V)纯化得2f。

向反应管中加入2f0.0354 g(0.2 mmol)和1 mL无水乙醇，于0 ℃搅拌使其溶解；用针筒注射溴丙酮酸乙酯38 μL(0.3 mmol)的无水乙醇(1 mL)溶液，于60 ℃反应6 h。抽滤，滤饼用无水Na2SO4干燥，蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚=1/4，V/V)纯化得3f。

2f： 黄色固体，收率85%, m.p.209.0～210.3 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 13.69(s, 1H, NH), 9.57(brs, 1H, NH2), 9.44(brs, 1H, NH2), 8.69(d,J=8.3 Hz, 1H, Ar-H), 7.61(d,J=8.4 Hz, 1H, Ar-H), 7.42～7.39(m, 1H, Ar-H), 7.27(t,J=7.6 Hz, 1H, Ar-H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 191.3, 142.1, 141.8, 126.7, 123.8, 122.8, 122.8, 111.2; MS(ESI)m/z: 178.1{[M+H]+}, 200.2{[M+Na]+}。

2g： 黄色固体，收率77%, m.p.104.5～105.3 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.11(brs, 1H, NH2), 7.77(s, 2H, Ar-H), 7.39(brs, 1H, NH2), 6.46(s, 1H, Ar-H), 3.67(brs, 2H, NH2);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 191.7, 151.5, 147.2, 136.6, 136.1, 134.0(JC-F=34.5 Hz), 126.1(JC-F=3.7 Hz), 122.0(JC-F=273.9 Hz), 94.1; MS(ESI)m/z: 355.0{[M+H]+}, 377.0{[M+Na]+}。

2h： 黄色固体，收率87%, m.p.198.1～199.7 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.11(brs, 1H, NH2), 7.79(s, 2H, Ar-H), 7.47(brs, 1H, NH2), 5.27(brs, 2H, NH2), 3.46～3.33(m, 2H, CH2), 1.40(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 189.4, 150.9, 147.2, 136.7, 136.6, 134.9, 134.5(JC-F=34.6 Hz), 126.2, 121.9(JC-F=274.0 Hz), 98.8, 48.5, 6.0; MS(ESI)m/z: 431.0{[M+H]+}, 452.8{[M+Na]+}。

2i： 黄色固体，收率62%, m.p.78.4～79.9 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.06(brs, 1H, NH2), 7.81(s, 2H, Ar-H), 7.44(brs, 1H, NH2), 5.31(brs, 2H, NH2);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 188.3, 151.9, 148.9, 136.8, 136.7, 134.9(JC-F=34.9 Hz), 134.3, 126.5(JC-F=341.5 Hz), 126.4(JC-F=3.8 Hz), 126.3(JC-F=3.9 Hz), 121.9(JC-F=274.1 Hz), 92.9; MS(ESI)m/z: 470.9{[M+H]+}, 493.2{[M+Na]+}。

3f： 白色固体，收率81%, m.p.163.6～164.3 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 13.69(s, 1H, NH), 8.53(s, 1H, Ar-H), 8.36(d,J=8.1 Hz, 1H, Ar-H), 7.66(d,J=8.4 Hz, 1H, Ar-H), 7.50～7.47(m, 1H, Ar-H), 7.34(t,J=7.4 Hz, 1H, Ar-H), 4.37(q,J=7.1 Hz, 2H, CH2), 1.36(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 162.7, 161.2, 147.3, 141.9, 138.6, 128.6, 127.7, 123.0, 121.8, 120.1, 111.4, 61.3, 14.7; MS(ESI)m/z: 273.8{[M+H]+}, 295.8{[M+Na]+}。

3i： 白色固体，收率35%, m.p.119.9～120.8 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.16(s, 1H, Ar-H), 7.79(s, 2H, Ar-H), 5.36(brs, 2H, NH2), 4.42～4.32(m, 2H, CH2), 1.40(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 161.0, 158.5, 151.3, 147.8, 146.0, 137.0, 136.9, 134.8(JC-F=34.6 Hz), 134.4, 127.9, 126.2(JC-F=339.6 Hz), 126.4, 126.3, 121.9(JC-F=274.3 Hz), 89.2, 61.5, 14.1; MS(ESI)m/z: 566.8{[M+H]+}, 588.9{[M+Na]+}。

(3)2j的合成

在反应瓶中加入19.3 g(60 mmol) 5-氨基-3-氰基-1-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯基)吡唑(1j)和150 mL二氯甲烷，于-15 ℃搅拌使其溶解；滴加氯化硫2.5 mL(31 mmol)的二氯甲烷(20 mL)溶液，搅拌反应过夜。加入三乙胺调节pH至6～7，抽滤，滤饼依次用二氯甲烷和蒸馏水洗涤两次，用环己烷重结晶得淡黄色针状晶体2j18.4 g，收率84.6%。

(4)3j的合成

在100 ml圆底烧瓶中，依次加入2j0.7019 g(1 mmol)，连二硫酸钠0.0348 g(3 mmol)， 1,2-二溴乙烷129 μL(4 mmol)，DMF/H2O(9 mL，V/V=8/1)，橡胶塞封口，加装氮气球，40 ℃搅拌反应12 h后冷却至室温。用CH2Cl2(3×150 mL)和饱和食盐水(3×150 mL)萃取，合并有机相，抽滤，经无水Na2SO4干燥，蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(乙酸乙酯/石油醚=1/3，V/V)纯化得新型含硫吡唑杂环化合物3j。

3j： 白色固体，收率56%, m.p.161.1～162.5 ℃;1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ: 7.80(s, 2H, Ar-H), 4.29(s, 2H, NH2), 3.51(t,J=7.4 Hz, 2H, CH2), 3.10(t,J=7.4 Hz, 2H, CH2);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 150.3, 136.6, 134.9(JC-F=32.3Hz), 132.5, 126.5(JC-F=3.8 Hz), 123.1, 120.9, 112.5, 94.5, 38.7, 30.3; MS(ESI)m/z: 458.5{[M+H]+}, 480.3{[M+Na]+}。

(5)4j的合成

向反应管中依次加入3j0.0912 g(0.2 mmol)，无水碳酸钾0.0553 g(0.2 mmol)，DMF/H2O(2 mL，V/V=400/1)，封管，80 ℃搅拌反应12 h后冷却至室温。用CH2Cl2(3×150 mL)和饱和食盐水(3×150 mL)萃取，合并有机相，抽滤，经无水Na2SO4干燥，蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(乙酸乙酯/石油醚=1/2，V/V)纯化得新型含硫吡唑杂环化合物4j。

4j： 淡黄色固体，收率50%, m.p.180.4～182.3 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.76(s, 2H, Ar-H), 3.67(t,J=3.8 Hz, 3H, NH, CH2), 3.00～2.95(m, 2H, CH2);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 143.7, 136.2, 136.0, 133.3(JC-F=33.7 Hz), 127.0(JC-F=3.6 Hz), 123.7(JC-F=182.7Hz), 113.6, 91.80, 60.2, 42.4, 24.6;MS(ESI) m/z: 378.9{[M+H]+}, 400.7{[M+Na]+}。

(6)5j的合成

向反应管中依次加入4j0.0756 g(0.2 mmol)和乙醇1 mL，于0 ℃搅拌使其溶解；缓慢滴加间氯过氧苯甲酸(m-CPBA)0.0518 g(0.3 mmol)的乙醇(1 mL)溶液，封管，搅拌下于40 ℃反应15 min。冷却至室温，抽滤，滤饼用无水Na2SO4干燥，蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯)纯化得5j。

5j： 白色固体，收率85%, m.p.235.7～237.8 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.32(d,J=1.4 Hz, 1H, Ar-H), 8.29(d,J=1.4 Hz, 1H, Ar-H), 8.24(d,J=4.5 Hz, 1H, NH), 3.76～3.46(m, 2H, CH2), 3.21～2.55(m, 2H, CH2);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 146.3, 135.9, 135.8, 134.8, 133.3(JC-F=34.0 Hz), 126.8(JC-F=3.4 Hz), 126.0, 122.4(JC-F=269.1 Hz), 112.0, 102.0, 43.5, 31.0; MS(ESI)m/z: 394.8{[M+H]+}, 416.2{[M+Na]+}。

1.3 抗菌活性测定

采用生长速率法[15-16]测试了目标产物对稻瘟病菌的抑菌活性。将化合物溶于二甲基亚砜中，制备为浓度10 mg·mL-1的母液，将母液(150 μL)与15 mL熔融的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)在低温(约40 ℃)下混合，最终药物浓度为100 mg·L-1(1%二甲基亚砜)。随后，立即倒入直径为90 mm的培养皿中，形成2～3 mm厚的平板。实验设含有浓度为1%的二甲基亚砜作空白对照。

冷却后，将培养好的待测病原菌，在无菌条件下用直径为5 mm的灭菌打孔器，自菌落边缘切取菌饼，用接种针将菌饼将直径5 mm的菌丝盘放置在每个平板的中心，接种器一侧朝下。将培养皿于28 ℃避光培养，直到菌丝到达对照培养皿的边缘，每个实验重复3次。用十字交叉法测量抑菌圈直径(D)3次，取平均值，计算抑菌率,结果见表1。

2 结果与讨论

2.1 抗稻瘟病菌活性

表1为14种含硫吡唑杂环化合物对稻瘟病菌的抗菌活性结果。由表1可知，当用药量为100 mg·L-1时，所有化合物对稻瘟病菌都有一定的抑制效果。其中，化合物3c对稻瘟病菌的抑制率达到63.6%，化合物2f对稻瘟病菌的抑制率达到81.9%，化合物2i对稻瘟病菌的抑制率达到65.3%，相较于合成的其他化合物表现出较好的抑制稻瘟病菌的生物活性。但是，与市场主流杀菌剂多菌灵(Carbendazim)的活性相比，还有较大差距。对标高效、广谱的多菌灵，有利于后续对含硫吡唑杂环化合物继续改造以提高其抗菌活性。

表1 含硫吡唑杂环化合物对稻瘟病菌的抗菌活性

2.2 构效关系

目标化合物的活性测试结果显示，当吡唑的1-位取代基为苯基，3-位取代基为甲基时，表现出较好的抗菌活性，达63.6%；若3-位取代基由甲基替换成苯基，其抗菌活性大幅度下降，为3.4%。因此，3-位的取代基对抗菌活性可能有较大影响，在此位点活性取代基的衍生有待进一步的深入研究；对比化合物2f和3f以及2i和3i，将硫代酰胺基团成环为噻唑，其抗菌活性分别从81.9%急剧下降为8.1%， 65.3%下降为56.4%，说明硫代酰胺基团对反应活性的影响较大。此外，对比化合物2g～2i，吡唑的4-位的三氟甲基亚磺酰基有利于提高抗菌活性。

合成了14种含硫吡唑杂环化合物，其中化合物3j，4j，5j为新化合物。抑菌实验结果表明，在100 mg·L-1浓度下，大部分化合物对稻瘟病菌表现出一定的抑制活性。其中化合物3c对稻瘟病菌的抑制率达到63.6%；化合物2f对稻瘟病菌的抑制率达到81.9%；化合物2i对稻瘟病菌的抑制率达到65.3%。后续课题组将会对含有硫代酰胺基团的化合物作进一步衍生和扩展，合成活性更好的含硫吡唑杂环衍生物。