果王素对Lewis肺腺癌小鼠移植瘤瞬时受体电位M8的影响

邓湘 贺兼斌 刘理静 龙兴云

近5年的流行病学调查显示肺部恶性肿瘤是最常见的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺部恶性肿瘤最常见的类型，占比超过85%[1～3]。近年NSCLC 的诊断率明显提高，但患者5年生存率仅为15.6%[4]。目前NSCLC 治疗的首选仍是化疗，但化疗药物副作用大、治疗费用高等问题导致患者难以完成全部周期化疗，使得化疗的治疗有效率低于15%[5]。因此，从天然植物中提取并开发安全性高、价格低廉且对肿瘤治疗有效的药物十分迫切。

瞬时受体电位M（Transient receptor potential melastatin，TRPM）成员在各种癌症中的作用已经被证实，其中一个通道TRPM8 是钙离子（Ca2+）渗透性通道，TRPM8 的过表达导致乳腺、肺部、胰腺和前列腺恶性肿瘤的发生和发展[6～9]。因此，TRPM 蛋白可能是影响肿瘤治疗效果的重要靶点。

果王素是通过临界CO2萃取法从猕猴桃果仁中萃取而成的果仁油，主要有效成分为非饱和脂肪酸（α-亚麻酸），萃取的果仁油具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用[10～12]。课题前期研究发现，果王素可抑制小鼠肺腺癌的生长[12～14]。然而，果王素能否通过调控TRPM8 的表达对肺腺癌产生抑制作用尚不清楚。本研究观察不同剂量果王素对肺腺癌小鼠移植瘤生长及肿瘤组织中TRPM8 mRNA 和蛋白表达的影响并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料从中国医学科学院基础医学研究所细胞中心购买Lewis 肺腺癌荷瘤种鼠2 只和C57BL/6J小鼠32 只。C57BL/6J 小鼠均为雄性，4～5 周龄，无特定病原体（Specefic pathogen free，SPF）级，体质量（20±2）g，动物许可证号：SYXK[京] 2019-0019。果王素由湘西老爹生物有限公司提供，为黄色油性液体，每升液体含果王素600g。兔抗鼠TRPM8 抗体和兔抗β肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体购于美国Santa Cruz 公司；Trizol 购于美国Invitrogen 公司；逆转录试剂盒购于北京康为世纪生物公司；PCR扩增试剂盒购于加拿大Fermentas 公司；TRPM8、β-actin 引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 建立动物模型 按照本课题组前期报道的方法建模[14]。无菌环境下，将处死的Lewis 肺腺癌荷瘤种鼠剥离肿瘤，留取肿瘤组织。按1g 组织∶4ml NaCl 的比例在表面皿中剪碎肿瘤组织，剪碎后的组织进行研磨；研磨后经0.042mm 孔径360 目钢网滤过，使用生理盐水将组织过滤液调节成细胞数为2×106个/ml 的瘤细胞悬液。在C57BL/6J 小鼠右后腿根部外侧，皮下注射0.2ml 肿瘤细胞悬液，建立肺腺癌小鼠皮下移植瘤模型。

1.2.2 分组及处理 按随机数字表法将32 只小鼠分为对照组、低剂量果王素组（60mg/kg）、中剂量果王素组（120mg/kg）、高剂量果王素组（240mg/kg）。接种肿瘤细胞后第4 天对照组予以生理盐水0.3ml 灌胃，每日1 次；低剂量果王素组予以60mg/kg 果王素0.3ml 灌胃，每日1 次；中剂量果王素组予以120mg/kg果王素0.3ml 灌胃，每日1 次；高剂量果王素组予以240mg/kg 果王素0.3ml 灌胃，每日1 次。接种后第24天处死全部小鼠并剥离皮下移植瘤。

1.2.3 RT-PCR 检测小鼠移植瘤组织TRPM8 mRNA表达 取部分肿瘤组织加入液氮研磨，以Trizol试剂提取各组肿瘤组织样本中的总RNA，按照Fermentas 公司RNA 逆转录试剂盒说明书进行逆转录。目的基因TRPM8 的参数：95℃预变性30s，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35 个循环。TRPM8 上游引物序列为5'-TGCCATCTCCTA CGCTCTA-3'，下游引物序列为5'-TTCGCAACCAGT TTCCAG-3'。内参β-actin 的上游引物序列为5'-CA CGGCATTGTAACCAACTG-3'，下游引物序列为5'-TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG-3'。产 物长度400bp。内参β-actin 的反应条件为95℃预变性1min，95℃变性5s，60℃退火20s，72℃延伸15s，共40 个循环。以β-actin 为内参定量TRPM8 mRNA 的表达水平。

1.2.4 Western blot 法检测小鼠移植瘤组织TRPM8蛋白水平 加入液氮研磨部分肿瘤组织，使用RIPA 蛋白裂解液从肿瘤组织中提取细胞蛋白，采用BCA 法测定蛋白质浓度。电泳、转膜、封闭蛋白膜、一抗和二抗孵育、ECL 法显影，使用Image J 软件分析显影条带，以β-actin（43kDa）为内参，测定TRPM8（38kDa）蛋白的表达，经Labwork 凝胶图像分析系统计算TRPM8 蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，采用t检验及单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠皮下移植瘤生长情况小鼠于接种肿瘤细胞后第24 天均存活。接种后第4 天，小鼠右侧后腿根部外侧处均见小结节样肿瘤生长。各组小鼠皮下移植瘤在第4～10 天大致相同，第16～24 天果王素组小鼠皮下移植瘤生长明显慢于对照组。与对照组相比，果王素组皮下移植瘤的体积、质量均减小（P<0.05）；与低剂量果王素组相比，中剂量、高剂量果王素组皮下移植瘤的体积、质量均减小，且高剂量果王素组减小更明显（P<0.05）。见表1。

表1 各组小鼠移植瘤生长情况比较（±s）

表1 各组小鼠移植瘤生长情况比较（±s）

注：与对照组相比，aP<0.05；与低剂量果王素组相比，bP<0.05；与中剂量果王素组相比，cP<0.05

分组 n 肿瘤体积（cm3） 肿瘤质量（g）对照组 8 6.79±0.23 6.10±.0.19低剂量果王素组 8 6.15±0.26a 5.49±0.29a中剂量果王素组 8 5.67±0.14ab 4.97±0.19ab高剂量果王素组 8 4.98±0.29abc 3.82±0.21abc

2.2 各组小鼠皮下移植瘤组织TRPM8 的mRNA表达水平RT-PCR 检测结果显示，与对照组相比，果王素组皮下移植瘤组织TRPM8 mRNA 表达均不同程度降低（P<0.05）；与低剂量果王素组相比，中剂量、高剂量果王素组皮下移植瘤组织TRPM8 mRNA 表达均降低，且高剂量果王素组降低更明显（P<0.05）。见图1、表2。

图1 各组移植瘤组织TRPM8 mRNA 表达

2.3 各组小鼠皮下移植瘤组织TRPM8 的蛋白表达水平Western blot 法检测结果显示，与对照组相比，果王素组皮下移植瘤组织TRPM8 蛋白表达均不同程度降低（P<0.05）；与低剂量果王素组相比，中剂量、高剂量果王素组皮下移植瘤组织TRPM8蛋白表达均降低，且高剂量果王素组降低更明显（P<0.05）。见图2、表2。

图2 TRPM8 蛋白在各组中的表达

表2 各组移植瘤组织中TRPM8 mRNA 及蛋白表达（±s）

表2 各组移植瘤组织中TRPM8 mRNA 及蛋白表达（±s）

注：与对照组相比，aP<0.05；与低剂量果王素组相比，bP<0.05；与中剂量果王素组相比，cP<0.05

分组 n TRPM8 mRNA TRPM8 蛋白对照组 8 85.54±1.53 100.34±3.22低剂量果王素组 8 68.21±2.11a 83.10±2.65a中剂量果王素组 8 59.41±1.43ab 75.66±3.48ab高剂量果王素组 8 43.97±2.66abc 60.55±3.51abc

3 讨论

NSCLC 是全球癌症相关死亡的主要原因，主要包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌[15]。随着生活水平提高，人们对健康的要求也不断提升，从天然植物中提取和开发安全有效的抗癌药物已成为防治肺癌的新手段。研究显示，许多天然植物的化合物如黄芪多糖、参麦、姜黄素等具有抑制肺癌生长和转移的作用[16～18]。非饱和脂肪酸（α-亚麻酸）为果王素主要药理成分。本研究复制高转移肺腺癌皮下移植瘤动物模型，使用不同剂量的果王素进行干预，结果显示：对照组皮下移植瘤的体积、质量明显大于各剂量果王素组，并且随着果王素处理剂量的增大抑制肿瘤生长效果越明显，尤其以240mg/kg果王素效果最强，各组间相比差异均有统计学意义（P<0.05）。

肿瘤的一个重要治疗靶点是离子通道，细胞内Ca2+浓度超标将降低细胞存活率，TRPM8 是一个非选择性阳离子通道，通过控制Ca2+流动调控细胞内外的平衡。TRPM8 通道激活后允许Ca2+向细胞内流动，Ca2+又作为第二信使调控肿瘤细胞的增殖、迁移等生物学行为[19]。TRPM8 被认为在肿瘤细胞增殖和凋亡中发挥作用且与患者的不良预后有关[20，21]。为探讨果王素能否通过影响TRPM8 的表达起到抑制肺腺癌生长的作用，本研究采用RT-PCR 检测小鼠皮下移植瘤中TRPM8 mRNA 表达水平，结果表明果王素干预可降低肿瘤组织中TRPM8 mRNA 的表达，果王素的剂量越大，则TRPM8 mRNA 的表达越低。Western blot 法检测TRPM8 蛋白的表达水平，结果表明对照组TRPM8 蛋白表达较高，而60mg/kg、120mg/kg、240mg/kg 果王素干预后TRPM8蛋白的表达呈逐渐降低趋势，其中240mg/kg 果王素干预降低最明显。上述实验结果提示果王素对肺腺癌移植瘤的生长有良好的抑制效果，并与剂量相关。

综上所述，果王素能抑制肺腺癌小鼠移植瘤的生长，其机制可能与降低TRPM8 基因表达及减少TRPM8 蛋白产物有关，本研究为果王素应用于治疗肺癌提供了理论与药理学依据。果王素作为一种容易获取的生物提取物，具有潜在的应用前景。