基于生物信息学的糖尿病肾病差异表达基因筛选和发病机制研究

李君李见王世信

在发达国家，糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）已成为慢性肾脏病（Chronic kidney disease，CKD）和肾功能衰竭（Renal failure，RF）的主要原因。在过去的二十年中，DN 的发病率和死亡率在世界范围内迅速上升[1，2]。除健康问题，DN 还增加了患者和社会的经济负担。DN 进展迅速，患者能较快地发展为终末期肾病[3，4]。已有报道表明，DN的发病机制涉及代谢和血流动力学多因素的相互作用，如高血糖、肾素-血管紧张素系统和晚期糖基化终末产物[5]。但DN 的发病机制尚未完全明确，其潜在的干预靶点和途径亟待挖掘。本研究利用生物信息学方法挖掘DN 发生和发展的潜在机制，为DN 的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 DN 差异表达基因筛选在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）中检索获取芯片数据。下载GSE14 2153 数据集，该数据集包含23 例DN 患者（DN 组）和10 例健康对照者（对照组）的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）的基因表达数据，实验平台为Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray4x44K G4112F（美国安捷伦）。利用R 语言软件中的“limma”和“pheatmap”对GSE 142153 数据集进行标准化处理，以P<0.05、|fold change|≥2 为条件进行差异表达基因筛选和聚类分析。

1.2 DN 差异表达基因富集分析以P<0.05 为条件，利用R 语言“ClusterProfiler”数据包对筛选得到的DN 差异表达基因进行信号通路和基因本体（Gene oncology，GO）富集分析，并将富集结果可视化。

1.3 DN 差异表达基因的蛋白质相互作用（Proteinprotein interaction，PPI）网络的构建使用STRING数据库（https://string-db.org）“Multiple Proteins”功能，设定物种为“智人”（Homo sapiens），将DN 差异表达基因导入系统检索，设定评分分值>0.4，隐藏独立的靶点，构建PPI 网络。以网络节点度值为参考，利用Cytoscape3.7.2 软件（http://www.cytoscape.org）中的cytoHubba 插件筛选PPI 网络中的核心靶点[6]。

1.4 DN 差异表达基因功能聚类利用基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）方法，借助GSEA v4.1.0 软件分析DN 差异表达基因数据，以归一化富集得分（Normalized enrichment score，NES）绝对值>1、P<0.05、错误发现率（False discovery rate，FDR）<0.25 为条件筛选DN 差异表达基因富集的生物学功能[7]，了解它们在特定功能基因集中的表达状况。

2 结果

2.1 DN 差异表达基因筛选经筛选，与正常对照组相比，DN 组样本存在160 个差异基因，其中上调基因100 个，下调基因60 个，见表1。

表1 DN 差异表达基因

2.2 DN 差异表达基因富集分析上调的差异表达基因显著富集于肿瘤坏死因子（TNF）、NOD 样受体（NLR）、核转录因子Kappa B（NF-κB）、白细胞介素17（IL17）等信号通路上，涉及平滑肌细胞增殖等生物学功能；下调差异表达基因显著富集在趋化因子信号通路上，涉及巨噬细胞迁移调节等生物学功能，见图1。

图1 DN 差异表达基因富集分析

2.3 DN 差异表达基因的PPI 网络构建和信号通路富集分析白细胞介素6（IL6）、CXC 趋化因子配体8（CXCL8）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、白细胞介素1B（IL1B）是DN 上调差异表达基因PPI 网络中的核心靶点；细胞表面趋化因子受体2（CCR2）、趋化因子（C-X3-C-基元）受体1（CX3CR1）是DN下调差异表达基因PPI 网络中的核心靶点，见图2。

图2 DN 差异表达基因的PPI 网络

2.4 DN 差异表达基因功能聚类DN 差异表达基因富集于血管新生、细胞凋亡、缺氧、凝血等生物学过程，见图3。

图3 DN 差异表达基因生物学功能富集

3 讨论

DN 是最常见的慢性肾脏疾病，也是终末期肾功能衰竭的主要原因。DN 被认为是血流动力学和代谢因素相互作用的结果，其发病机制涉及多因素、多途径，其中免疫反应和炎症起主要作用[8]。慢性肾功能不全与肾脏炎症有关，巨噬细胞及NF-κB 信号通路参与其中[9]。高血糖状态可激活单核巨噬细胞系统，导致肾脏组织的巨噬细胞浸润，诱导细胞因子释放和单核巨噬细胞募集，最终导致炎症反应，同时，肥大细胞等炎性相关细胞也渗入肾小管间质，释放炎症介质和蛋白水解酶，参与这一病理过程[10]。

NF-κB 信号通路是经典的炎性反应通路，控制着参与免疫反应和炎症等不同过程的基因的表达。在DN 发病过程中，NF-κB 信号通路会调控肾脏结构改变和功能异常等分子和生物学途径，如肾素-血管紧张素系统的激活、晚期糖基化终末产物的积累和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸主导的氧化应激等，处于DN 相关炎性反应的核心地位[11]。

TNF-α 在DN 发病过程中发挥重要作用，可通过影响白细胞的募集和激活，加剧DN 相关的炎症反应。TNF-α 与两种细胞表面受体——TNFα 受体1 和2 相互作用发挥其生物学作用，这两种受体已被认为是一种新的预测DN 预后的生物标志物[12]。在DN 中，TNF-α 及其受体参与细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞外基质蛋白的合成，并介导对足细胞、系膜细胞、内皮细胞和上皮细胞的多种细胞毒作用[13]。一项荟萃分析表明，2 型糖尿病患者和DN 患者血清TNF-α 浓度均增加，且DN 患者血清TNF-α 浓度高于2 型糖尿病患者[14]。

NOD 样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3)是经典的炎症因子，活性氧诱导激活的NLRP3 参与肾损伤的发生发展。糖尿病患者体内活性氧水平升高，当NLRP3 激活时，NLRP3 可同时激活半胱氨酸蛋白酶-1（CP-1），诱导炎反应[15]。研究证实，NLRP3 在DN 大鼠肾脏中高表达，而NLRP3 炎性小体下游的IL-1 和IL-18 水平也明显升高，提示DN 的发生和发展与NLRP3 的激活有关[16]。

IL-17A 是先天免疫的重要调节因子，主要由Th17 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞和肥大细胞产生，与多种炎症性疾病的发病机制有关。有研究表明，IL-17A 缺乏可减轻移植肾的急慢性损伤，改善肾功能，延长移植肾存活时间[17]。但目前IL-17 在DN 中的具体作用尚未完全明确。Kim等[18]报道，通过霉酚酸酯靶向Th17 细胞减轻DN模型小鼠肾损伤，表明调节IL-17 可能是治疗DN的可行方法。另有研究证实，在糖尿病大鼠模型中，用雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂治疗可以减弱Th17 活性和肾脏损伤[19]。与上述研究结果不同，Mohamed 等[20]研究证实，IL-17A 和IL-17F 对DN有保护作用。Ma 等[21]研究也发现，IL-17 缺乏症减弱了DN 模型小鼠促炎基因的表达，表明IL-17对链脲佐菌素诱导的DN 具有保护作用。

趋化因子在细胞募集和迁移中起关键作用，根据功能不同，趋化因子又被定义为稳态趋化因子和炎性趋化因子，其中炎性趋化因子与促炎机制有关，并诱导白细胞向受损组织募集[22]。趋化因子与DN 的发生密切相关。当间充质干细胞暴露在DN 的炎症环境中时，可以通过释放趋化因子来协调局部和全身的先天和适应性免疫反应[23]。在DN动物模型中，不同家族的众多趋化因子，如CCL2、CCL20、CXCL5、CXCL7 和CXCL12，在肾小球和近端小管中增加[24，25]。

经拓扑分析，IL6、CXCL8、MMP9、IL1B 是DN上调差异表达基因PPI 网络中的核心靶点，CCR2、CX3CR1 是DN 下调差异表达基因PPI 网络中的核心靶点。IL-6 是一种在炎症病理中起关键作用的细胞因子。一项评估IL-6 与DN 发病相关性的荟萃分析研究表明，IL-6 的等位基因，如rs1800795、rs1800796 和rs1800797 在DN 的发生和发展中有重要作用[26]。另有研究证实，DN 患者尿液中IL-6 水平升高，这一现象在肾脏预后较差的患者中尤为明显[27]。重组人趋化因子CXCL8（IL-8）及其受体是DN 进展的主要参与者。IL-8 主要激活中性粒细胞募集并诱导氧化应激，增加DN 的血管通透性和内皮损伤[28]。在亚洲人群中，IL-8 的等位基因IL8-rs4073 与DN 的发生有很强的相关性[29]。研究表明，CXCL8 升高是导致糖尿病小鼠肾脏损伤和中性粒细胞积聚的关键因素，在糖尿病小鼠模型中应用CXCL8 拮抗剂（G31P），G31P 治疗组肾功能障碍明显减轻[30]。IL-1β 由巨噬细胞产生，是免疫系统中的关键因子，可触发肾细胞产生其他次级促炎介质[31]。临床研究表明，IL-1β 受体拮抗剂-阿那白滞素（Anakinra）可改善血糖和β 细胞功能，降低全身炎症标志物[32]。另有研究表明，新的IL-1β抑制剂——利纳西普（Rilonacept）降低了慢性肾脏病患者的全身炎症反应[33]。CC 族趋化因子受体2（CCR2）参与免疫炎性反应，CC 族趋化因子配体2（CCL2）水平升高与肾小球损伤、肾脏炎症和肾功能下降密切相关。研究表明，CCR2 拮抗剂可以降低DN 肾脏巨噬细胞的聚集和损伤[34]。实验研究表明，阻断CCR2 受体可以减少DN 模型小鼠蛋白尿和降低肾小球纤维化水平，恢复肾功能[35]。趋化因子受体CX3CR1 在单核细胞和循环淋巴细胞中高表达，与肾脏疾病密切相关。研究表明，CX3CR1 的配体CX3CL1 可通过特异性阻断巨噬细胞上的CX3CR1表达，发挥减少缺血肾脏巨噬细胞的浸润作用，减轻缺血再灌注损伤后的肾纤维化改变[36]。

GSEA 富集分析表明，DN 发病涉及血管新生、细胞凋亡、缺氧、凝血等生物学过程。Wilson 等[37]对DN 肾脏标本进行单细胞测序发现，肾小球、近曲小管、远曲小管的细胞呈现典型的血管新生表型。Jin 等[38]研究发现，脂肪干细胞外泌体可以上调足细胞miR-486 的表达，抑制Smad1/mTOR 信号通路，减少细胞凋亡，改善DN 症状，表明DN 发病涉及细胞凋亡表型。肾小管缺氧是DN 早期和晚期的共同特征，DN 动物模型中，近端肾小管上皮细胞和DN 患者肾组织中缺氧诱导因子-1α 表达升高[39]。糖尿病患者的血液呈高凝状态，可加重肾脏损伤，DN 患者活化部分凝血活酶时间缩短，提示DN 患者内源性凝血功能增强[40]。

综上所述，与健康人群相比，DN 患者PBMCs基因表达存在显著差异，其病理过程与TNF、NLR、NF-κB、IL-17、趋化因子等信号通路有关。IL6、CXCL8、MMP9、IL1B、CCR2、CX3CR1 是DN 发 病过程中的核心靶点。DN 病理过程涉及血管新生、细胞凋亡、缺氧、凝血等生物学过程。