毛蕊花糖苷对热损伤睾丸间质细胞凋亡的保护作用

陈 雪，王 莺，康 晶，赖增妍，郑连文 , 赵东海

(1.吉林医药学院基础医学院，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院临床医学院，吉林 吉林 132013；3.吉林大学第二医院，吉林 长春 130041)

因生活习惯改变，如久坐、缺乏运动等，会使男性睾丸处于高温环境中，进而导致氧化应激损伤发生。有报道称，小鼠在热应激损伤后，不仅睾丸组织受到损害，而且精子质量也会发生异常，导致生殖功能低下[1]。

毛蕊花糖苷是中药肉苁蓉的有效成分[2]。有研究表明，毛蕊花糖苷可改善小鼠睾丸萎缩和雄激素减少，减少勃起潜伏期和增加精子数量[3]。目前，有关毛蕊花糖苷在雄性生殖功能改善的研究尚不深入，相关的作用机理仍不清晰。本试验通过制备热应激损伤睾丸间质细胞(TM3)模型，观察毛蕊花糖苷对TM3热应激损伤的保护作用和机制，从而为毛蕊花糖苷在雄性生殖损伤保护中的开发和应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 F12培养液、胎牛血清、青霉素、链霉素，美国Sigma 公司；总蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒，碧云天生物科技有限公司；兔抗人Bax多克隆抗体、兔抗人Bcl-2多克隆抗体、兔抗人Cleaved-caspase 3多克隆抗体,美国Cell Signal公司；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒，江苏凯基生物公司。

1.2 主要仪器 倒置光学显微镜(奥林巴斯)；高速低温离心机(德国Ependoff公司)；电泳仪、电转移仪、垂直电泳槽(美国BioRad 公司)；CO2培养箱、旋涡震荡仪(美国Thermo公司)。

1.3 试验对象 细胞株TM3，购自中国科学院细胞库。

1.4 试验方法

1.4.1 试验设计 TM3用含1%双抗、10%胎牛血清的F12培养液培养，置于5% CO2、饱和湿度、37 ℃ 培养箱中。定期换液，并根据生长情况传代。试验分为6组：正常对照组、热损伤模型组、毛蕊花糖苷低、中、高剂量组和阳性对照组。根据预试验结果以及参考文献[4]方法，TM3置于5% CO2、饱和湿度、40 ℃培养箱中制备热应激损伤TM3细胞模型。将对数生长期TM3消化后，以1×105个/mL的浓度接种于96孔板中。培养24 h后，热损伤模型组、毛蕊花糖苷组和阳性对照组TM3移至5% CO2、40 ℃培养箱。其中，毛蕊花糖苷低、中、高剂量组分别加入终浓度为25、50 μg/mL和100 μg/mL的毛蕊花糖苷。根据参考文献[5]，阳性对照组加入终浓度为50 IU/mL的维生素C，每组设3个复孔。

1.4.2 MTT法测定各组TM3存活率 各试验组细胞培养4 h后,加入终浓度0.5 μg/mL的MTT继续培养4 h。吸取上清液，加入150 μL DMSO，振荡混匀10 min后使用酶标仪测定490 nm处吸光度值(A)。假设正常对照组细胞全部存活，计算其余各组存活率。细胞存活率=(试验组平均A值/对照组平均A值)×100%。

1.4.3 Annexin V/PI检测细胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化对数生长期的细胞，洗涤离心后加入100 μL 1×Binding buffer重悬。加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液混匀，避光室温反应10～15 min。加400 μL 1×Binding buffer，混匀置于冰上，1 h内用流式细胞仪检测。用Cell Quest软件进行分析，以FITC为横坐标，PI为纵坐标，绘制散点图。

1.4.4 Western Blot法测定TM3凋亡相关蛋白基因Caspase-3、Bax与Bcl-2的表达 收集各组TM3，用预冷的PBS清洗，加入RIPA裂解液，超声3%功率，冰上裂解5 min后，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，用溴酚蓝和裂解液将蛋白调整成等浓度后，煮沸10 min，变性后的蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，湿转2 h到PVDF膜上，TBST配制的5%(体积分数)脱脂奶粉室温封闭1 h，然后将PVDF膜与经TBST稀释的一抗(Caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶500、Bcl-2 1∶500)4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次10 min后加入1∶5 000 的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜10 min，洗膜3次后，ECL化学发光试剂盒显色，进行拍照及灰度值分析。

2 结果

2.1 毛蕊花糖苷与热应激损伤TM3存活率 与正常对照组比较，热损伤模型组部分细胞变圆，部分细胞脱落悬浮于培养液中，细胞存活率降低(P<0.01)。不同剂量毛蕊花糖苷作用4 h后，与模型组相比，低剂量组细胞存活率升高(P<0.05);中、高剂量组细胞存活率显著升高(P<0.01)，且呈浓度依赖性。毛蕊花糖苷高剂量组细胞存活率与阳性对照组相近(P>0.05)。见图1。

图1 毛蕊花糖苷对热应激损伤TM3存活率的影响

2.2 毛蕊花糖苷与热应激损伤TM3凋亡率 正常对照组、模型组、毛蕊花糖苷低、中、高剂量组和阳性对照组的总凋亡率分别为(8.27±0.35)%、(30.33±0.81)%、(24.31±1.02)%、(18.23±0.64)%、(11.26±0.17)%和(10.43±0.53)%。本试验中热损伤4 h后，模型组TM3凋亡率与正常对照组比较明显升高(P<0.01)。与模型组相比，不同剂量毛蕊花糖苷作用4 h后，低剂量组TM3凋亡率降低(P<0.05)；中剂量组和高剂量组TM3凋亡率明显降低(P<0.01)，且呈浓度依赖性；阳性药物组细胞凋亡率明显低于模型组(P<0.01)。见图2。

图2 毛蕊花糖苷对热应激损伤TM3凋亡的影响

2.3 毛蕊花糖苷与热应激损伤TM3的Cleaved-caspase 3、Bcl-2和Bax蛋白表达 如图3和图4所示，与正常对照组比较，热损伤模型组TM3的Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.01)，Cleaved-caspase 3和Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Bax/Bcl-2比值明显升高(P<0.01)。与热损伤模型组相比，不同剂量毛蕊花糖苷作用4 h后，低剂量组TM3 Bcl-2蛋白表达水平明显增高(P<0.05)，Cleaved-caspase 3、Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，Bax/Bcl-2比值降低(P<0.05)；中剂量组和高剂量组Bcl-2蛋白表达水平明显增高(P<0.01)，Cleaved-caspase 3、Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.01)，Bax/Bcl-2比值降低(P<0.01)，蛋白表达水平变化呈浓度依赖性。阳性药物组与模型组相比，Bcl-2蛋白表达水平明显增高(P<0.01)，Cleaved-caspase 3、Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.01)，Bax/Bcl-2比值明显降低(P<0.01)。

图3 毛蕊花糖苷对热应激损伤TM3 Cleaved-caspase 3、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

图4 毛蕊花糖苷对热应激损伤TM3 Cleaved-caspase 3、Bcl-2和Bax蛋白相对表达的影响

3 讨论

研究表明，睾丸长期处于高温状态的男性可出现生育力下降，主要表现为精子质量异常及不成熟精子比例增高[6-8]。目前，有多种途径促使小鼠睾丸受到热应激，如让小鼠睾丸置于高温水中、利用手术制造隐睾症和高温状态下饲养小鼠等，同时这些研究也证实睾丸受到热应激后会导致生育力下降[9-11]。毛蕊花糖苷是黄酮类的苯丙素糖苷单体，分子式为C29H36O15,分子量624.59，广泛存在于中草药植物中，在列当科植物肉苁蓉的肉质茎中含量较高。研究表明，毛蕊花糖苷具有多种药理活性，具有抗氧化[12]、肝保护[13]、抗炎和镇痛活性等[14]。本试验结果发现，经毛蕊花糖苷处理后，可使热损伤TM3存活率升高，凋亡率降低，并呈现剂量依赖关系。

细胞凋亡是细胞生长增殖过程中重要的调节方式，是由基因调控的主动死亡，可清除衰老、破损及具有潜在危险的细胞[15]。生精细胞的凋亡可以维持精子发生的动态平衡，保证成熟精子的数量和质量。有报道称，在男性不育的致病因素中，凋亡可能起着重要的作用[16-17],可能引起特发性少精、弱精、畸形精子症等[18-19]。一些学者还发现，男性不育及精子异常都与一些自发或化学因素诱发的凋亡过程密切相关[20-21]。

细胞凋亡的信号通路主要分为细胞表面死亡受体途径及线粒体凋亡通路[22-23]。Bcl-2家族蛋白是调控线粒体凋亡通路的关键因子[24]。其中，Bcl-2 是Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白,而Bax 是凋亡蛋白,二者可通过改变线粒体形态及外膜的通透性，影响膜间隙蛋白释放及Caspase级联活化调控细胞的凋亡[25]。细胞受到损伤刺激后，Bax 蛋白大量表达,导致线粒体膜通透性加强，细胞凋亡诱导因子(AIF)进入细胞质，激活Caspase 3 级联反应，激发细胞凋亡[26]。

热损伤可以导致位于线粒体和内质网的Bax 累积，当线粒体膜上的Bcl磷酸化失活后，逐渐累积的Bax会使线粒体释放出大量的细胞色素C，导致以Caspase 3为代表的凋亡蛋白家族的激活，最终导致细胞凋亡[27]。本试验结果显示，毛蕊花糖苷应用于热损伤TM3后，Bcl-2活性明显增高，Cleaved-caspase 3、Bax活性明显降低，Bax/Bcl-2比值降低，且呈浓度依赖性。表明毛蕊花糖苷可能通过抑制Caspase 3、Bax/Bcl-2信号通路实现抗凋亡作用。

综上所述，毛蕊花糖苷能够促进热损伤TM3增殖，降低热损伤TM3凋亡发生，其作用机制可能与毛蕊花糖苷通过调控Caspase 3、Bax/Bcl-2蛋白信号通路抑制凋亡的发生有关。本试验结果为男性不育的药物治疗提供了新思路,为研究毛蕊花糖苷的生精作用提供了科学依据。