鹅源鼠伤寒沙门菌的分离与耐药性分析

钟艺煊，周 佳，陈 革，王丽扬，王彦红，刘学忠

(1.扬州大学兽医学院 , 江苏 扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心 , 江苏 扬州 225009)

我国是畜禽养殖大国，而沙门菌病的发生与流行一直影响着畜牧业的健康发展，是现阶段养殖场重要的细菌性传染病之一[1]。鼠伤寒沙门菌属于沙门菌B群，是一种重要的人兽共患病病原，其感染率与发病率较高[2]。沙门菌有广泛的宿主范围，各年龄的动物均可以感染，通常侵害幼年和青年动物。鹅感染鼠伤寒沙门菌时，肝脏有明显的肿大、坏死，颜色呈古铜色；消化道呈现不同程度的充血、水肿、出血及灶性坏死[3]；同时伴有明显的心包炎和气囊炎。目前，临床主要通过抗生素来防治鼠伤寒沙门菌感染。由于不同地区分离得到的沙门菌有比较大的差异，部分养殖场不合理的使用抗生素，病原在比较长的时间内进行演化，进而导致耐药菌株的出现，加大了对沙门菌病的防治难度，对公共卫生构成严重的影响。本试验通过收集临床病料，进行病原分离和鉴定，开展药敏试验和相关耐药基因的检测，为鹅群鼠伤寒沙门菌病的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料的来源 所用的病料分别是从安徽、泰州和镇江送检的疑似沙门菌感染的病鹅的病变组织。

1.2 主要试剂 麦康凯培养基，购自杭州微生物制剂有限公司；沙门菌属诊断血清，购自宁波天润生物药业有限公司；肠杆菌科细菌生化管和药敏纸片，包括庆大霉素(10 μg)、阿莫西林(20 μg)、丁胺卡那(30 μg)、卡那霉素(30 μg)、头孢哌酮(75 μg)、头孢曲松(30 μg)、头孢噻肟(30 μg)、复方新诺明(23.75/1.25 μg)、链霉素(10 μg)、多西环素(30 μg)、诺氟沙星(10 μg)、氟苯尼考(30 μg)、环丙沙星(5 μg)、左氧氟沙星(5 μg)、多黏菌素B(300IU)、妥布霉素(10 μg)、美洛西林(75 μg)以及新霉素(30 μg)共18种 抗菌药，均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 细菌分离 采集肝脏、心脏、关节液等病料，无菌接种于麦康凯培养基上，置37 ℃恒温培养箱中培养12 h，挑选生长良好的菌落，在麦康凯培养基上进一步纯化培养。挑选纯培养后的单个菌落，按照《兽医微生物实验指导》[4]要求进行革兰染色，镜检，观察细菌的形态以及颜色。

1.4 生化试验 挑取纯培养后的单个菌落，接种于肠杆菌科细菌生化管中，37 ℃ 恒温培养12 h。

1.5 沙门菌侵袭蛋白A(invA)基因的PCR鉴别试验 通过特异性的亲膜蛋白invA基因的PCR扩增试验来鉴定沙门菌。所用的引物：F:5′-TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC-3′；R:5′-GCATTATC-GATCAGTACCAGCCGTCT-3′[5]。PCR扩增体系为20 μL，模板为纯化后的疑似沙门菌单菌落提取的DNA。扩增程序:95 ℃ 预变性5 min;94 ℃ 变性35 s，57 ℃退火 35 s，72 ℃ 延伸40 s，共32个循环；72 ℃ 终延伸7 min。将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 血清学试验 采用玻板凝集试验来进行血清学分型。首先取一环A～F多价血清于载玻片上，再挑取适量待检细菌，与之混合均匀，30 s内观察凝集情况。若产生颗粒状凝集则判断为阳性(反之，则为阴性)，阳性样品再分别选用O∶4、O∶9、O∶12、O∶5、O∶7 等因子血清进行玻板凝集试验，判定待检细菌的群别。根据判断的O抗原群别，进行H抗原的第一相和第二相判定。

1.7 药敏试验 取适量纯培养后的细菌，用十字划线法均匀涂在普通琼脂培养基上，将药敏试纸片轻轻贴于培养基表面，37 ℃恒温培养24 h，测量抑菌圈直径大小，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)动物种特异的兽医病原菌抑菌圈直径解释标准[6]进行判定。

1.8 β-内酰胺类抗生素相关耐药基因测定 挑取适量菌落，煮沸法制备细菌基因组模板。采用PCR扩增试验进行β-内酰胺类抗生素相关耐药基因的检测，测定基因为TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2和CTX-M-9，测定时需要使用的具体引物序列见表1。

表1 本试验所用PCR引物

2 结果

2.1 细菌分离 采集的病料(表2)分离后，在麦康凯培养基上生长良好，形成圆形、无色、大小均匀的菌落。将纯化后的细菌进行革兰染色，镜检可见革兰阴性中等大小的直杆菌，这些都与革兰阴性菌的镜检结果一致。

表2 细菌来源与血清型模式

2.2 生化试验 结果显示，10株分离株均不发酵乳糖，发酵麦芽糖，能发酵葡萄糖产酸产气，不利用水杨甘、蔗糖，也不产生α甲基葡萄糖苷。不能分解尿素，不产生吲哚，V-P试验阴性，甲基红试验阳性，在三糖铁琼脂上产生H2S，符合沙门菌的生化特性。

2.3invA基因的PCR鉴别试验 以10株分离株的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果均出现大小约为330 bp的目的条带(图1)，与预期的片段大小相符，即分离株为沙门菌。

图1 特异性亲膜蛋白invA基因的PCR鉴别

2.4 血清学试验 10株分离株的抗原模式全部与鼠伤寒沙门菌的抗原模式一致，为1，4，[5]，12：i，2，符合鼠伤寒沙门菌的抗原模式，均为鼠伤寒沙门菌(表2)。

2.5 药敏试验 10株鼠伤寒沙门菌分离菌株的药敏试验结果显示(表3)，所分离的菌株对氟苯尼考的耐药性为50%；对阿莫西林、美洛西林等药物的耐药性为30%；对环丙沙星、庆大霉素、头孢曲松等药物的耐药性为20%；但对头孢哌酮/舒巴坦的耐药性为0。且分离得到的20181226E1-3、20181226E1-4、20181226E1-S2、20181226E1-S3和20181226E1-T这5株分离株同时对喹诺酮类、氨基糖苷类、氯霉素类、四环素类和β-内酰胺类五类抗生素耐药，为多重耐药性菌株。

表3 分离株对不同抗菌药物的耐药情况

2.6 β-内酰胺类抗生素相关耐药基因测定 对10株鼠伤寒沙门菌进行β-内酰胺酶类抗生素相关耐药基因的检测,结果显示,20190111E1-1和20190111E1-2这2株鼠伤寒沙门菌分离株检出CTX-M-9(图2)，并且这2株都为CTX-M-65。TEM、SHV、CTX-M-1和CTX-M-2均未检出。

图2 CTX-M-9耐药基因PCR扩增

3 讨论

本试验分离出的10株鼠伤寒沙门菌均来自鹅，有7株来自泰州，2株来自镇江，1株来自安徽。沙门菌是一种严重危害家禽养殖业发展的细菌性病原微生物[8]，对雏鹅的危害非常大。

药敏试验结果显示，本次试验分离得到的10株菌株中已有5株为多重耐药菌株，而这5株分离株来自同一个养殖场。近年来，随着3代头孢菌素以及广谱β-内酰胺类抗菌药物在临床的广泛使用，革兰阴性杆菌中β-内酰胺酶的检出率也日益增高[9]，CTX-M型β-内酰胺酶已经取代SHV和TEM型β-内酰胺酶，成为革兰阴性杆菌中最常检出的基因型[10]。由质粒介导的β-内酰胺酶可通过转移接合作用(相同或不同种属细菌间)导致耐药基因的转移和扩散[11]，严重时会导致耐药菌株在局部大规模暴发[12]。本试验在20190111E1-1和20190111E1-2分离株中检测到耐药基因CTX-M-9，2株分离株均来自同一养殖场，且耐药表型为对头孢噻肟和头孢曲松均耐药，其余8株分离株对头孢噻肟和头孢曲松均不耐药，耐药基因和耐药表型的符合率为100%，这与余菊等[13]的沙门菌CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因分型及变异研究的结果相一致。

目前，尚且没有特别有效的疫苗来预防鼠伤寒沙门菌，因此在养殖过程中，需要加强对沙门菌病的防治工作，做到早发现、早诊断、早治疗，具体体现在病畜出现死亡时及时剖检进行细菌分离，并对分离菌株进行药敏试验，根据药敏试验的结果制定科学合理的用药方案。兽医主管部门要与时俱进，制定有效的防控措施，并且严格贯彻执行；平时加强对养殖户的培训；种畜禽场要做好净化工作，建立无沙门菌感染的种群[14]；加强对畜禽产品的检疫工作，最终保障人类的健康。