山西“农谷”肉鸡舍致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

2021-11-11牛晋国申李琰李惠龙张希瑶

中国兽医杂志 2021年6期

牛晋国，申李琰，李惠龙，张希瑶

(山西农业大学动物科学学院，山西太原 030032)

山西“农谷”是将山西省太谷县建设成为以特色产业、绿色养殖产业、设施农业、生物技术和农村产业融合发展的科技创新城[1]。白羽肉鸡的养殖是该“农谷”绿色养殖产业之一，2015年以来该县的肉鸡出栏量居山西省第一，为该省肉鸡产业的转型升级发展发挥着重要的作用[2]。鸡大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)引起的，是以侵害白羽肉鸡气囊、眼睛、呼吸道、消化道、内脏器官等为特征，引起肉鸡发病率和死亡率都非常高的细菌性疾病[3-5]。鸡大肠杆菌病在白羽肉鸡的养殖中常与其他疫病混合发生或在发生其他疫病后诱发该病，据报道APEC引发的疾病占白羽肉鸡细菌性疾病的50%～85%[6-7]。本试验采集了单栋饲养量为40 000只的白羽肉鸡舍内的不同来源样品(粪便、饲料、饮水、病鸡)，进行了大肠杆菌的分离鉴定与同源性分析，通过药敏试验与致病性试验，确定了分离菌的致病性与敏感的药物，为山西“农谷”肉鸡的大肠杆菌病预防与治疗提供有效的试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料营养琼脂、麦康凯琼脂培养基、LB肉汤培养基、伊红-美蓝琼脂，均购自青岛宾得生物技术有限公司；细菌微量生化反应管(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇，枸橼酸盐试验、硝酸盐试验、甲基红、硫化氢、蛋白胨水)和常用药敏试纸，均购自杭州滨和微生物试剂有限公司；革兰染色液，购自青岛海博生物技术有限公司；菌液PCR和16S rDNA鉴定由北京美吉桑格生物医药科技有限公司完成。

1日龄商品代雏鸡110只，购自山西省太原市智龙种鸡场。

SW-CJ-1F单人双面生物洁净工作台、FXB101-2鼓风干燥箱、FXB303-3恒温培养箱，均购自上海树立仪器仪表有限公司；XSP-8CA三目生物显微镜，购自上海光学仪器厂；SHY-2水浴恒温振荡器，购自江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；YM不锈钢立式电热蒸汽消毒器，购自上海三申医疗器械有限公司。

1.2 样品采集与处理

1.2.1 采样点 2018年8月6日在山西“农谷”某白羽肉鸡养殖基地，随机选取一栋饲养量为40 000只肉鸡的鸡舍，按照五点采样法，鸡舍中心和4个角位置为采样点，即鸡舍内2个边列的第2组和第41组鸡笼，中间列的第22组鸡笼，每组鸡笼的中间位置为采样点。

1.2.2 样品采集在鸡舍内采集样品，气源样品采用自然沉降法在麦康凯琼脂培养基平板采集15份，于每层鸡笼的上方打开暴露20 min；鸡粪源和饲料源样品各5份，拨开表层，取内部样；水源样品在采样位置的乳头饮水器，成股流出的中段样品5份；人粪源样品在鸡舍外露天厕所采集2份；鸡源样品采集病死鸡肝脏样品2份，每份样品1 g或1 mL左右，冰盒冷藏带回实验室，在12 h内处理。

1.2.3 细菌培养与纯化饲料、粪便和肝组织样品分别称取0.1 g，加200 μL生理盐水冲洗，采用三点法涂板，水源样品直接涂板麦康凯琼脂培养基，和气源样品平板一起放入温箱37 ℃，培养18～24 h。取出检查平板内菌落数大于100时，倍比稀释样品，重新涂板培养。选取平板内典型的粉红色菌落，划线接种到伊红美蓝琼脂培养基培养，37 ℃培养18 h；选取具有金属光泽的菌落接种至LB肉汤，37 ℃震荡培养6 h，转入温箱培养12 h，取纯培养菌液染色镜检。

1.3 分离菌的生化鉴定取分离菌培养菌液，接种于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇，枸橼酸盐试验、硝酸盐试验、甲基红、硫化氢、蛋白胨水等生化反应鉴定管，37 ℃温箱培养8～18 h，观察结果。

1.4 分离菌16S rDNA鉴定与同源性分析登录GenBank，根据大肠杆菌16S rDNA的保守基因片段，合成引物，引物序列为27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR采用25 μL反应体系，反应条件：预变性94 ℃，3 min；变性94 ℃，30 s，退火54 ℃，30 s，延伸72 ℃，90 s，24个循环；延伸72 ℃，10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性的纯化产物测序。引物合成及测序由北京美吉桑格生物医药科技有限公司完成。登录NCBI利用BLAST进行分离菌的16S rDNA序列比对，利用DNASTAR进行同源性分析，构建系统进化树。

1.5 药物敏感性试验按照美国临床和实验室标准协会(NCCLS)标准，采用纸片扩散法(Kirby-barer氏法)进行药物的敏感性试验(质控菌：ATCC25922)，根据抑菌圈大小判断敏感性[8]。

1.6 致病性试验健康1日龄雏鸡饲养至7日龄，选择活泼的雏鸡分为13组，每组6只，将按照麦氏比浊法调整菌落数为3×108CFU/mL的11组分离菌液腹腔注射各组雏鸡，每只0.5 mL，观察7 d内死亡情况，前3天每隔3 h观察1次，3 d后每天观察3次，取病变器官分离鉴定回收菌种；2个对照组：注射无菌肉汤组和不注射的空白对照组。

2 结果

2.1 细菌的分离纯化气源样品分离菌2株(命名为A22、A42)，鸡源分离菌4株(B11、B21、B15、B25)，鸡粪源分离菌1株(F33)，人粪源分离菌1株(M13)，饲料源分离菌2株(S11、S21)，水源分离菌1株(W32)。分离菌在麦康凯琼脂平板上长出光滑隆起的粉红色菌落；在伊红美兰培养基上形成具有金属光泽的圆形菌落(图1A)；在营养肉汤中培养后均匀浑浊；涂片后革兰染色呈阴性，镜检为两端钝圆的中等大小杆菌(图1B)。

图1 分离菌菌落形态和革兰染色镜检结果

2.2 生化鉴定分离菌生化管反应结果显示，可以发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇，MR试验、吲哚试验、硝酸盐试验呈阳性，枸橼酸盐、硫化氢试验呈阴性，符合大肠杆菌的生化鉴定特性。

2.3 16S rDNA基因PCR扩增与测序 PCR扩增16S rDNA基因得到了与预期大小相符的条带，约为1 450 bp，见图2。11株分离菌测序后，登录NCBI信息中心进行BLAST序列比对，与GenBank公布的大肠杆菌菌株的16S rDNA基因片段的同源性均达到99%～100%。

图2 分离菌16S rDNA 凝胶电泳结果

2.4 16S rDNA核苷酸序列同源性和进化树分析对不同来源的11个菌株的16S rDNA核苷酸序列用DNASTAR软件中的MegAlign模块下的Clustal W方法进行同源性分析并构建进化树，同源性分析见图3，分离菌的16S rDNA序列同源性在95.5%～99.4%。同源性最高的是菌株B15和B25，最低的是B15和W32、B21和W32。

图3 16S rDNA 基因核苷酸序列同源性分析

分离菌根据系统进化树大致可以分为4支，见图4。2株鸡源菌与1株人粪源菌进化树分析为同一小分支，与1株气源菌和另1株鸡源菌在同一分支；1株鸡源菌与1株鸡粪源菌在同一小分支，与1株饲料源菌和1株气源菌在同一分支；1株饲料源菌和1株水源菌各在一个分支，这2株和其他株之间亲缘关系较远。进化树分析表明，来自同一种样品的分离菌亲缘关系不一定比不同来源的菌株高，说明大肠杆菌菌型复杂，分布广泛。

图4 16S rDNA 基因核苷酸系统进化树分析

2.5 药敏试验 11株分离菌对20种药物的敏感程度见表1。由表1可知，分离菌对新霉素和氧氟沙星不耐药，对其他18种药物有不同程度的耐药性，对林可霉素、青霉素、卡那霉素、磺胺异噁唑耐药率较高。分离菌对新霉素、妥布霉素和阿米卡星敏感性较高，敏感率大于50%的还有头孢噻肟、头孢曲松、头孢唑啉、庆大霉素、环丙沙星，对林可霉素和青霉素的敏感率为0。

表1 11株分离菌对20种药物的耐药性分析

2.6 致病性试验雏鸡在接种后出现精神萎顿，畏寒，采食量、饮水量减少，拉绿色粪便，并在1～3 d内陆续出现死亡，致病情况见表2，死亡的雏鸡剖检可见气囊炎、肝周炎、心包炎等符合大肠杆菌病特征的病变。3 d后没有出现死亡，至育雏结束余下的试验雏鸡均健康生长。根据接种后雏鸡的发病时间、死亡情况以及症状与剖检变化等，可见菌株A22、F33、W32致病力较强，菌株A42、B25、S11、S21致病力中等，菌株B11、B15、M13致病力较弱，菌株B21致病力最弱。经鉴定每组试验雏鸡中分离到的菌株与原接种菌株一致。

表2 注射分离菌菌液后雏鸡致病力情况分析

3 讨论

鸡大肠杆菌病具有地域流行性，不易控制，是严重危害养鸡业的重要的细菌性传染病之一，且APEC的耐药基因可以通过禽肉、禽蛋等畜产品转移到人身上，构成公共卫生问题[9-10]。本试验在规模化肉鸡鸡舍内采集的34份不同源的样品中分离到了11株致病性大肠杆菌。16S rDNA同源性分析显示，鸡源菌与鸡粪源菌同源性最高，达到了97.8%～99.2%，由高到低依次是人粪源菌、气源菌、饲料源菌、水源菌，系统进化树分析也表明，鸡源菌与粪源菌、气源菌亲缘关系较近，与水源菌、饲料源菌较远。表明鸡群通过粪便传播和感染APEC的机会比空气、饲料和饮水的机会大。

药敏试验结果显示，11株APEC对18种药物存在不同程度的多重耐药，与2019年李蕴玉等[11]报道的唐山和秦皇岛地区分离的22株肉鸡源APEC的耐药率和2018年李明举等[12]报道的胶东地区分离的169株肉鸡大肠杆菌的耐药率相比，四环素类、磺胺类、喹诺酮类、β内酰胺类等药物的耐药性有不同程度的降低，卡那霉素升高，表明“农谷”鸡源大肠杆菌的耐药性比周边地区要低，耐药性有地区差异性。本试验结果与2015年宁官保等[13]报道的在山西省部分地区分离的20株大肠杆菌的耐药性和2018年尹娇娇等[14]从山西省晋中地区分离的8株鸡源APEC的耐药性相比，耐药性均有明显的降低，表明随着“农谷”养殖环境的不断改善与养殖水平的不断提高，APEC的耐药性在逐渐降低。

致病性试验结果表明，11株不同来源的APEC均有不同程度的致病性。鸡源APEC致病力不是很强，但其中B25株耐20种药物的耐药率高达55%，敏感率与B21株并列最低为15%。根据分离菌对药物的耐药率和敏感率，那么致病力较强的A22和F33可能成为下一个流行株，APEC的致病机制与耐药机制有待深入研究。因此，鸡场要加强环境消毒，消灭有害微生物，防患于未然。