布鲁氏菌疫苗(S2株)气雾免疫绵羊血清抗体阳性率优于口服免疫

黄 新，韩猛立，张星星，张 宾，汪 保，吴桐忠，晁旭东，何立雄，韩文国，蒲新竹，陈朝阳，罗文毅，彭 剑，何延华，钟发刚

(1.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆 石河子 832000；2.新疆生产建设兵团第四师畜牧兽医工作站，新疆 可克达拉 835219；3.新疆生产建设兵团第十师181团畜牧兽医工作站，新疆 巴里巴盖 836001；4.新疆生产建设兵团第四师71团畜牧兽医工作站，新疆 新源 835801；5.新疆生产建设兵团第四师70团畜牧兽医工作站，新疆 伊宁 835116)

布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是危害我国极为严重的人兽共患传染病，该病不但严重影响公共卫生安全，而且制约了牛羊养殖业的发展[1-2]。目前，国内外主要采取扑杀和免疫预防的措施防控该病。我国已出台以疫苗免疫为主的防控策略，各地疫苗广泛的使用在防控布病中发挥了重要的作用[3-5]，但由于各类疫苗、免疫方式及其免疫程序的不一，以及免疫前阳性淘汰扑杀机制不健全，造成各地的免疫覆盖范围和免疫效果差异大，导致布鲁氏菌病自然感染和免疫牛羊共存，患病动物无法识别剔除。当前，较大的疫情虽有所减少，但感染畜潜在危害短期内难以遏制，广大牧民感染的风险长期存在[6-7]。布病M5和S2株疫苗在我国广泛应用，S2株主要口服免疫，M5株主要皮下注射免疫[8-10]。20世纪70年代，我国青海和新疆在条件较差的山区都使用M5疫苗开展过气雾免疫工作，也取得了一定的效果[11-13]。黏膜免疫是模拟自然感染途径，直接刺激呼吸道和消化道黏膜下丰富的淋巴组织产生大量免疫活性细胞和抗体，切断病原微生物入侵机体[14]。本课题组借鉴M5疫苗气雾免疫方法，研制密闭式气雾免疫装置，使用致病力更弱的布鲁氏菌S2疫苗株，开展布鲁氏菌疫苗气雾免疫试验，探究不同免疫剂量后布病抗体消长规律。试验的开展为气雾免疫防控羊布鲁氏菌病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 布鲁氏菌疫苗 布鲁氏菌病活疫苗(S2株)为新疆天康股份有限公司产品(生产批号：2017009)，疫苗中活菌数不低于1×1010菌落总数/毫升(Colony-forming units/mL，CFU/mL)。

1.2 抗体检测试剂 虎红平板凝集抗原(IDEXX，SN:405-100)及阴阳性血清、试管凝集抗原(IDEXX，SN:214)及阴阳性血清，均为北京爱德士元亨生物科技有限公司产品。

1.3 气雾免疫装置 该装置为2016年本课题组设计研发，发明专利：一种家畜免疫消毒方法及专用装置(CN201710131959)。通过该装置进行布鲁氏菌气雾免疫。

1.4 免疫羊群 试验羊群为未免疫过布鲁氏菌疫苗，虎红平板凝集试验(Rose bengal plate agglutination test，RBPT)和试管凝集试验(Standard-tube agglutination test，SAT)检测阴性的健康绵羊，羔羊为3～4月龄，成年羊为2岁，均为新疆阿勒泰本地杂交羊。

1.5 免疫方法 口服免疫使用专用口服投服器，一人保定羊，一人实施免疫；气雾免疫使用课题组自主研发的气雾免疫装置实施分批免疫[15]。

1.6 试验分组 将免疫羊群按照气雾免疫组和口服免疫组分为2个大组，试验期为1年。试验分组见表1。口服免疫组：免疫剂量(Immunizing dose, IMD)为1×1010CFU，口服器投服100只羊，根据年龄分为2个小组，即成年羊口服免疫组和羔羊口服免疫组。气雾免疫组：633只羊按免疫剂量分成7个小组，使用气雾免疫装置分批次进行免疫，剂量分别为1×1010、8×109、6×109、4×109、2×109、1×109CFU和5×108CFU，每组86～95只羊，各试验组羊只分别隔离饲养。

表1 免疫分组

1.7 血清学检测 采集疫苗免疫后的第30、60、90、120天和第320天血清，进行RBPT和SAT检测。检测方法和判定参照国家标准GB—18646(2002)。

2 结果

2.1 口服免疫后抗体阳性率及其消长曲线 免疫后30～320 d羔羊和成年羊RBPT和SAT阳性率结果如表2所示，羔羊在30 d(RBPT:38.00%，SAT:32.00%)，成年羊在30 d(RBPT:72.00%，SAT:68.00%)，均达到最高值，两者的RBPT和SAT检测阳性率比较，成年羊比羔羊分别高出34.00%和36.00%。羔羊和成年羊在免疫后60、90 d和120 d阳性率都降低，成年羊的阳性率分别高出羔羊30.00%、12.00%和2.00%。经卡方检验，RBT与SAT方法检测阳性率数差异不显著(P>0.05)。如图1所示，根据羔羊和成年羊口服免疫SAT检测结果，建立30～320 d抗体消长曲线，成年羊和羔羊抗体阳性率变化趋势基本一致，羔羊及成年羊抗体阳性率均在免疫后30 d达到峰值，羔羊的峰值比成年羊低36.00%，30～60 d下降较快，90～120 d下降缓慢。

表2 口服免疫后30～320 d的羔羊、成年羊抗体阳性率变化

图1 口服免疫后30～320 d的羔羊、成年羊抗体阳性率消长曲线

2.2 气雾免疫后羔羊抗体阳性率及其消长曲线 如表3所示，免疫后30 d各剂量组阳性率最高仅为40.00%，60 d阳性率降至20.00%，90 d后降至10.00%。经卡方检验，RBT与SAT方法检测布病抗体阳性率差异不显著(P>0.05)，不同免疫剂量下相同免疫后时间点的抗体阳性率差异不显著(P>0.05)。如图2所示，使用SAT阳性率结果建立免疫后30～320 d抗体消长曲线，各剂量组抗体阳性率在30 d时达到峰值，30～120 d快速下降，120 d后 SAT检测阳性率降至0。

图2 不同剂量气雾免疫后30～320 d的羔羊抗体阳性率消长曲线

表3 不同剂量气雾免疫后30～320 d的羔羊抗体阳性率变化

2.3 气雾免疫后成年羊抗体阳性率及其消长曲线 如表4所示，与羔羊免疫剂量相同，6个组(除5×108CFU组)，免疫后30 d RBPT和SAT平均阳性率分别为95.47%和86.84%(RBPT：94.67%～96.15%；SAT:84.81%～88.50%)，比成年羊口服免疫组30 d RBPT和SAT抗体阳性率分别高出23.47%和18.84%；免疫后60 d、90 d、120 d和320 d各组阳性率分别降至53.33%、24.39%、10.00%和5.00%；5×108CFU组30 d阳性率较低(RBPT:48.70%，SAT:44.73%)。经卡方检验：RBT与SAT方法检测布病抗体阳性率差异不显著(P>0.05)，在免疫后30 d和60 d，5×108CFU组SAT抗体阳性率与其他6个组差异极显著(P<0.01)。如图3所示，使用成年羊SAT阳性率结果，建立免疫后30～320 d抗体消长曲线，各剂量组免疫后抗体阳性率快速升高，到30 d时达到峰值，30～90 d抗体阳性率快速下降，90～320 d下降较慢。5×108CFU组与其他6个组相比较，30 d曲线波峰较低，30 d后的曲线下降趋势较一致。

图3 不同剂量气雾免疫后30～320 d的成年羊抗体阳性率消长曲线

表4 不同剂量气雾免疫后30～320 d的成年羊抗体阳性率变化

3 讨论

我国老一辈兽医工作者，在40年前非常简陋的设施和条件情况下，开展了布鲁氏菌气雾免疫的多项研究和免疫工作，取得了较好的效果[11-13]，本课题组借鉴这一思路，自行设计研制了一套气雾免疫装置，使用毒力更低的布鲁氏菌S2疫苗开展气雾免疫研究。为了方便运输，使用集装箱为免疫仓，同时增加消毒喷淋装置、负压装置和升降装置等保障整个免疫过程顺利进行，同时尽可能减少密封仓疫苗的外泄，确保免疫过程的操作者及牧工的安全。

黏膜免疫是直接应用疫苗到黏膜表面，如消化道、呼吸道、泌尿生殖道黏膜，诱导局部黏膜产生免疫应答反应。黏膜免疫最大的优点是可以模拟自然感染途径，直接刺激呼吸道和消化道黏膜下丰富的淋巴组织产生大量免疫活性细胞和抗体，直接切断病原微生物入侵机体的途径[16-17]，因此，黏膜免疫对阻止由黏膜入侵机体内的病原微生物效果较好。布鲁氏菌为胞内寄生菌，病菌自皮肤或黏膜侵入机体，黏膜免疫为其最佳的选择。

通过口服与气雾免疫后30 d抗体转阳率比较，成年羊气雾免疫的转阳率更高，比口服免疫平均高20.00%～30.00%。成年羊气雾免疫后除免疫剂量5×108CFU组外，30 d的转阳率均在较高水平，表明气雾免疫在使用1×109～1×1010CFU剂量的疫苗，均可达到较高抗体转阳率。这与疫苗口服后不能耐受胃酸和各种蛋白酶的降解，抗原吸收较少有关。而通过呼吸道免疫具有抗原诱导免疫反应阈值低、抗原用量少、不受消化酶影响的特点[18]。

本试验采用RBT与SAT两种方法对免疫后抗体进行检测，其阳性率变化趋势一致，差异不显著。使用气雾免疫的各组抗体阳性率变化趋势虽然相同，但是5×108CFU组阳性率较低，与其他6个组在免疫后30 d和60 d差异较显著，这可能与免疫剂量过低，不能够刺激机体产生足够的免疫有关[19-20]。分别使用口服和不同梯度气雾剂量免疫羔羊，免疫后30 d的抗体转阳率较低(30.00%)，这可能与幼畜的免疫及生殖器官尚未发育成熟有关[19-20]，所以不建议幼畜过早免疫布鲁氏菌疫苗。