松果菊苷对帕金森病模型大鼠中脑超微结构的影响

★ 林瑶 黄云梅 钱长晖 林如辉 许茜 袁明洲 唐岚芳 黄佩珍 蔡晶（.福建中医药大学中西医结合学院 福州 50；.福建中医药大学中西医结合研究院 福州 50；.福建中医药大学修园临床医学院 福州 50）

帕金森病（parkinson's disease, PD）是世界第二大神经系统退行性病变，其典型的病理表现是中脑黑质致密部多巴胺能神经细胞的大量变性缺失，神经细胞丢失的主要机制之一是细胞凋亡［1］。松果菊苷（echinacoside，ECH）是一种天然苯乙醇苷类化合物,存在于大量中药中,如肉苁蓉、地黄、玄参、马先蒿、列当等,尤其在肉苁蓉中含量最高,可达30 %，其药理作用包括抗凋亡、抗氧化、抗炎症、抗衰老等［2］。肉苁蓉作为传统补肾中药，能补肾阳、益精血，课题组前期研究已发现肉苁蓉以及以肉苁蓉为君药的中药复方苁蓉舒痉颗粒能改善帕金森病模型大鼠的行为学，减轻多巴胺能神经细胞的凋亡［3-5］。

本实验通过观察松果菊苷对帕金森病模型大鼠中脑黑质神经细胞超微结构的影响，为进一步阐明肉苁蓉对PD模型大鼠的神经细胞保护作用及机制提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠35只，SPF级,体重（180±20）g，由福建中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号码：SCXK（沪）2012-0002。实验条件：室温20～22 ℃，相对湿度60 %～65 %，自动光-暗控制（7:00-19:00光照,19:00-7:00暗置），摄食饮水自由。

1.2 试药与仪器 松果菊苷（07538，Sigma）；鱼藤酮（R8875，Sigma）；葵花油（S5007，Sigma）；乌拉坦（30191218， 国药集团化学试剂有限公司）; 电镜固定液（G1102，Servicebio）；无水乙醇（100092183，国药集团化学试剂有限公司）；812 包埋剂 （90529-77-4，SPI）。H-7650 透射电子显微镜（日本日立公司）；UC6 超薄切片机（德国莱卡公司）。

2 方法

2.1 动物模型建立 PD模型制备采用Sherer［6］创立的经典方法：将鱼藤酮溶于葵花油乳化液，使其终浓度为1.5 mg/mL，按1.5 mg/（kg·d）注射剂量给予大鼠颈背部皮下注射，连续14 d。观察大鼠的行为学改变，参照Voitenko［7］的行为学评分标准进行评分，2～8分者为合格的PD模型大鼠。

2.2 实验分组及给药 将35只健康SD大鼠按SPSS 24.0软件产生的随机数字分为对照组（不予处理）10只，造模组25只。造模组大鼠按2.1中的造模方法建立PD模型。造模结束后，行为学评分1分2只，10分3只，造模成功的大鼠共20只。将造模成功的20只大鼠再次按SPSS 24.0软件随机分为模型组、松果菊苷组，每组10只。手术及实验期间死亡大鼠不计入总数。对照组和模型组用生理盐水灌胃，松果菊苷组用2 mg/mL的松果菊苷水溶液灌胃，三组大鼠灌胃剂量均为1 mL/（100g·d），每天一次，连续14 d。实验过程中，每天观察各组大鼠进食、饮水、活动、精神等一般情况，并做好记录。

2.3 透射电子显微镜观察大鼠黑质纹状体超微结构 给药结束后，将各组大鼠以20 %乌拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉，于冰上迅速剥离中脑黑质纹状体，置于3 %戊二醛固定液中，乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋，制备超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅染色，透射电镜下观察神经细胞超微结构变化。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况比较 造模前各组大鼠毛色、活动、体型等情况无明显差异。模型组大鼠于造模第7天开始逐渐出现主动活动减少、拒捕行为减弱、弓背向上抬高、单侧斜卧、行走困难。松果菊苷组主动活动均较模型组大鼠有所增加，毛色较为光亮，行动有所改善。见图1。

图1 松果菊苷对PD模型大鼠一般情况的影响

3.2 松果菊苷对PD模型大鼠中脑黑质纹状体超微结构的影响 对照组大鼠黑质纹状体区域神经细胞结构清晰，细胞核圆形或者椭圆形，核膜光滑、完整，核染色质在核内均匀分布，未见核染色质边聚；细胞质内细胞器丰富，线粒体数量较多，散在分布，形态规则完整，呈圆形或长杆状，内外膜结构清楚，线粒体嵴结构清晰，呈板状排列；细胞内未发现凋亡小体。见图2中A、D图。

模型组大鼠与对照组比较，神经细胞整体电子密度较高，胞体固缩，膜结构完整，可见核染色质聚集并分布于核膜下，核膜增厚，胞浆内出现空泡；胞浆内线粒体数量减少，出现肿胀，双层膜结构不清, 线粒体嵴排列紊乱模糊不清。见图2中B、E图。

松果菊苷组与模型组比较，神经细胞胞体大小有所恢复，胞膜完整，核染色质边集现象有所缓解，核膜增厚有所减轻，胞浆内空泡减少；线粒体数量有所增加，双层膜结构清晰，线粒体嵴排列相对规律，形态基本正常。见图2中C、F图。

图2 松果菊苷对PD模型大鼠中脑黑质纹状体超微结构的影响

4 讨论

帕金森病典型的临床症状有静止性震颤、肌强直、运动迟缓、运动迟缓等，其发病的重要病理生理基础是中脑黒质区多巴胺能神经细胞大量凋亡，导致产生的多巴胺不足，抑制性神经递质多巴胺与兴奋性神经递质乙酰胆碱之间的平衡失调所致［8］。因此,目前对帕金森病的治疗思路主要是口服西药左旋多巴来补充减少的多巴胺。但是左旋多巴发挥作用的前提是要有足够数量的多巴胺能神经细胞，而这种治疗方案并不修复受损的神经细胞。随着病程的进展，神经细胞丢失越来越多，导致长期口服左旋多巴治疗效果并不理想，且用药后期也易出现开关现象等并发症。

中医理论认为帕金森病属于颤证，病位在脑，而脑为髓海，肾藏精生髓，肾虚则精不上承而脑髓空虚，因此补肾填精、益髓养脑是中医治疗帕金森病的重要思路［9］。肉苁蓉味甘、性温，具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥等功效。课题组前期研究也发现肉苁蓉无论是单用还是作为君药组成复方，都能减轻患者的症状，提高患者的UPRDS评分，对PD模型大鼠的行为学有一定程度的改善，还能降低神经细胞中凋亡因子的含量，对中脑神经细胞有一定的保护作用［3-5］。

松果菊苷是肉苁蓉中提取的主要活性成分，Liang［10］研究发现，松果菊苷可以缓解 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（ 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP） 诱导的PD小鼠的运动功能障碍，抑制 PD 小鼠纹状体内多巴胺能神经元的凋亡。在本实验中发现，松果菊苷给药后，PD模型大鼠一般情况有所改善，体现了松果菊苷对PD模型大鼠的保护作用。透射电镜结果提示，鱼藤酮造模后，神经细胞出现了胞体固缩，核染色质边聚等细胞凋亡的特征性改变；松果菊苷给药后，细胞大小有所恢复，核染色质边聚的现象有所缓解，体现了松果菊苷能减轻鱼藤酮造成的细胞凋亡。电镜形态学观察是检测细胞凋亡的“金标准”，以上结果从形态学角度验证了文献报道。

线粒体功能障碍是造成细胞凋亡的常见原因。线粒体功能障碍会影响呼吸链复合物I的活性，导致活性氧生成增多，线粒体膜电位去极化，线粒体膜通透性转运孔道开放，释放细胞色素C、凋亡诱导因子等，引起细胞凋亡［11］。本实验观察发现，模型组线粒体数量减少，出现肿胀、膜结构不清、嵴排列紊乱等线粒体损伤表现，而松果菊苷给药后，线粒体数量、形态都出现恢复，提示松果菊苷可能是通过减轻线粒体功能障碍来缓解细胞凋亡。

中医讲究辨证论治和整体观念，中药具有副作用相对较小的优势，但也存在成分复杂、靶点不清的特点。本实验通过对PD模型大鼠中脑神经细胞超微结构的观察，发现肉苁蓉主要活性成分松果菊苷对线粒体功能障碍有一定缓解，进而能减轻鱼藤酮诱导的细胞凋亡。在进一步的研究中，期待能找到松果菊苷作用的靶点，为进一步阐述中药肉苁蓉保护神经细胞的机制提供依据。