中风复元合剂的纯化工艺研究

★ 李智勇 卢泳,3 张建军 陈雪婷 李洁环（1.广东省第二中医院/广东省中医药工程技术研究院 广州 510095；2.广东省中医药研究开发重点实验室 广州 510095；3．广州中医药大学 广州 510405）

中风复元合剂是广东省第二中医院康复科的临床经验方，主要由黄芪、赤芍、当归、陈皮、石菖蒲等组成，对于中风恢复期和后遗症期中风后肩手综合征等具有良好疗效。根据临床需求，拟将其制成可以方便患者携带、服用的合剂，以提高患者的顺应性。中药合剂制备过程中由于煎液服用体积大、有效成分含量低等缺点，药液的纯化成为合剂生产过程中关键步骤之一。目前较常用的中药水提液纯化技术主要有水提醇沉法、吸附澄清法［1-2］、超滤法［3］、大孔树脂吸附法［4］、无机陶瓷膜微滤法、高速离心法等［5-6］。本研究在前期制备工艺研究的基础上，优选纯化工艺方法，并采用正交试验进一步优化中风复元合剂提取液的纯化工艺参数。

1 仪器与试药

1.1 仪器 DC-NSG-30多功能提取浓缩机组（上海达程实验设备有限公司）；R1005型旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；BPG-9070A型精密鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；KQ-300DE型数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；LXJ-IIB型低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药 芍药苷对照品（110736-201640）和橙皮苷对照品（110721-201115）均购自中国食品药品检定研究院；实验用中药饮片均购于广东康圣中药饮片有限公司，经广东省中医药工程技术研究院王洛临主任中药师鉴定，均符合《中华人民共和国药典》2015年版一部各有关项下的要求；ZTC1+1天然澄清剂、壳聚糖、101果汁澄清剂（北京正天成澄清技术有限公司）；甲醇（色谱纯；赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 中风复元合剂提取浓缩液的制备［7］按处方称取当归、陈皮、石菖蒲加8倍量水，蒸馏提取5 h，收集100～150 mL含挥发油蒸馏液，蒸馏后的水溶液滤过，备用。药渣与黄芪等七味药加水煎煮2次，每次加药材量8倍水煎煮1 h，滤过，合并滤液与蒸馏后的水溶液，浓缩至约900 mL，加入蒸馏水至1 000 mL，搅匀，备用（药液质量浓度约相当于1.0 g生药量/mL）。

2.2 评价指标的选择 方中君药赤芍主要起活血、化瘀、止痛的作用，其中所含的芍药苷是其具有抗炎、抗凝、抗血栓形成等作用的主要药效活性成分［8-9］，另石菖蒲、陈皮、当归三味饮片中均含有挥发油［10-12］，是化痰通络、通窍醒脑的重要成分之一。因此，试验中拟选定芍药苷和橙皮苷的相对保留率作为评价指标，并结合可以间接反映饮片中物质煎出多少的固形物得率，采用综合加权评分法，将各指标成分的总量分别转换为综合评分值，其中固形物得率（Wi）的加权系数为0.2，芍药苷（Xi）和橙皮苷（Yi）相对保留率的加权系数各为0.4。针对综合评分最高的纯化方法，并采用正交试验进一步优选中风复元合剂提取液的纯化工艺参数。计算公式如下：

2.2.1 芍药苷和橙皮苷的含量测定

2.2.1.1 色谱适应性 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-水（B）梯度洗脱：0～20 min，A：20 %～100 %；20～30 min，A：100 %～5 %；30～35 min，A：5 %；35～40 min，A：5 %～ 20 %；40～50 min，A：20 %；检测波长：230 nm；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃。

2.2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷和橙皮苷对照品各适量，加甲醇制成每1 mL含芍药苷224.4 μg，橙皮苷174.8 μg的混合对照品溶液。

2.2.1.3 供试品溶液的制备 吸取样品液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.1.4 阴性对照溶液的制备 照处方比例称取除赤芍外的饮片和除陈皮外的饮片各一份，分别制备缺赤芍和缺陈皮的阴性供试品，再照供试品溶液的制备方法分别制备赤芍阴性对照溶液和陈皮阴性对照溶液，备用。

2.2.1.5 专属性试验 吸取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各5 μL，进行测定，记录色谱图，见图1。结果显示，芍药苷阴性对照图谱和橙皮苷阴性对照图谱分别与混合对照品、供试品图谱中芍药苷和橙皮苷相应的保留时间处无色谱峰，表明阴性无干扰。

图1 中风复元合剂HPLC图

2.2.1.6 线性关系 精密吸取混合对照品储备溶液分别配置每1 mL含芍药苷22.44、44.88、67.32、89.76、112.2、224.4 μg和橙皮苷17.48、34.96、52.44、69.92、87.40、174.8 μg的系列混合对照品溶液。吸取上述对照品溶液各5 μL，进行测定，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），分别绘制芍药苷、橙皮苷的标准工作曲线。结果显示：芍药苷在22.44～224.40 μg/mL范围内，Y芍=1.521 4X芍+18.245，r芍=0.999 95；橙皮苷在17.48～174.8 μg/mL范围内，Y橙=1.943 5X橙+16.167，r橙=0.999 95，表明线性均良好。

2.2.1.7 测定法 精密吸取供试品溶液，对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱，测定，计算，即得。

2.2.2 固形物得率的测定 照固体总量测定法（《中国药典》2015年版四部通则3101）［13］试验，精密移取供试液25 mL，置于已恒重的100 mL蒸发皿中，干燥至恒重，转移至干燥器中，冷却至室温，称量，计算固形物得率。

2.3 纯化工艺筛选

2.3.1 纯化样品溶液的制备

2.3.1.1 未纯化对照液 取提取浓缩液200 mL，浓缩转移至100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。

2.3.1.2 高速离心法 取提取浓缩液200 mL，5 000 r/min离心20 min，取上清液浓缩并转移至100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。

2.3.1.3 乙醇沉淀法 取提取浓缩液200 mL，加入乙醇，边加边搅拌，使含醇量达60 %（V/V），静置24 h，过滤，上清液回收乙醇，浓缩转移至100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。

2.3.1.4 壳聚糖澄清法 取提取浓缩液200 mL，调节pH至5.00，60 ℃保温，加入40 mL的1 %壳聚糖醋酸溶液（取壳聚糖粉末10 g，加1 %的醋酸溶液200 mL，搅拌使溶解，静置24 h，即得），匀速搅拌10 min，取出，静置24 h，滤过，滤液5 000 r/min离心20 min，上清液浓缩转移至100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。

2.3.1.5 101果汁澄清剂澄清法 取提取浓缩液200 mL，加入20 mL的5 % 101果汁澄清剂溶液（取101果汁澄清剂10 g，加入蒸馏水200 mL，匀速搅拌，静置24 h，即得），匀速搅拌10 min，取出，静置24 h，滤过，滤液5 000 r/min离心20 min，上清液浓缩转移至100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。

2.3.1.6 ZTC1+1澄清剂澄清法 取提取浓缩液200 mL，加入6 mL组分B溶液（取ZTC1+1澄清剂B组分2 g，加入1 %醋酸溶液200 mL，搅拌均匀，静置24 h，滤过，即得），60 ℃水浴，搅拌10 min，保温20 min，然后加入3 mL组分A溶液（取ZTC1+1澄清剂A组分2 g，加入蒸馏水200 mL，搅拌均匀，静置24 h，滤过，即得），60 ℃水浴，搅拌10 min，保温20 min，取出，静置24 h，滤过，滤液5 000 r/min离心20 min，上清液浓缩转移至100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。

2.3.2 纯化工艺的筛选结果 分别测定上述纯化样品溶液中芍药苷和橙皮苷的含量及固形物含量，分别计算芍药苷和橙皮苷的相对保留率以及固形物得率、综合评分。结果见表1。

表1 纯化方法考察结果 %

结果显示，ZTC1+1澄清剂澄清法相对其他纯化方法相比较，综合评分较优，选作为中风复元合剂的纯化工艺，并采用正交试验设计法进一步优选纯化工艺参数。

2.4 正交试验优化纯化工艺参数 以药液浓度、澄清剂的加入量、水浴温度为考察因素，每个因素取三个水平，采用L9（34）正交试验进行中风复元合剂的ZTC1+1澄清剂澄清法纯化工艺参数优选。因素和水平见表2，试验设计与结果见表3，方差分析见表4。通过直观分析可知，随着药液浓度的增加，固形物得率呈上升趋势；芍药苷相对保留率随药液浓度增加而逐渐下降；橙皮苷相对保留率与药液浓度的相关性不明显。方差分析结果表明，药液浓度、ZTC1+1澄清剂的用量、水浴温度三者对试验结果均无显著影响（P＞0.1）。结合节约能源、降低生产成本等因素，拟选择A2B2C1作为中风复元合剂的纯化工艺，即药液浓度为1.0 g/mL，ZTC1+1澄清剂的用量为4.5 %，水浴温度为40 ℃。

表2 因素和水平表

表3 L9（34）正交试验方案与结果 %

表4 方差分析结果

2.5 验证实验 按处方比例称取中风复元合剂提取液（每1 mL约相当于1.0 g生药）3份，每份200 mL，分别加入3 %（V/V）的ZTC1+1组分B溶液，40 ℃水浴搅拌10 min，保温20 min，然后加入1.5 %（V/V）的ZTC1+1组分A溶液，40 ℃水浴搅拌10 min，保温20 min，取出，静置24 h，滤过，5 000 r/min离心20 min，滤过，上清液适当浓缩，转移至100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，分别测定芍药苷和橙皮苷相对保留率以及固形物得率。测定结果见表5，结果显示，验证实验的综合评分与正交试验的综合评分最大值相接近，说明优选的中风复元合剂提取液纯化工艺合理、稳定可行。

表5 验证实验结果 %

3 讨论

中风是以脑部缺血及出血性损伤为主要临床表现的疾病，具有发病率高、合并症多、复发率高、致残率高及治愈率低的特点，是目前严重危害中老年人健康的主要疾病之一，目前大部分中医学者认为中风后遗症之病机是气虚血疲与脉络阻滞［14］。中风复元合剂对于中风恢复期和后遗症期中风后肩手综合征等的治疗效果良好，将其制备成便于携带、服用的合剂，更加适应现代生活需求。

中药提取液具有体积大，成分复杂且杂质较多，有效成分含量比较低等特点，因此其纯化技术在中药制剂的前处理中具有重要的意义。研究中采用单因素对比法研究水提醇沉法等纯化技术，结果显示使用ZTC1+1澄清剂纯化，除杂效果明显，用量少、工序简单、生产效率高［15］。正交试验优选结果显示，药液浓度、ZTC1+1澄清剂的用量、水浴温度三者对试验结果（纯化效果）均无显著影响。考虑投入工业生产后的经济成本与能源损耗问题，最终选择纯化工艺的参数为药液浓度1.0 g/mL，ZTC1+1澄清剂的用量4.5 %，水浴温度40 ℃。验证结果显示，该纯化方法基本合理、稳定可行，提取液经过纯化后可使制剂更加稳定，为其进一步研究开发提供了依据。