痰瘀同治法对糖尿病大鼠心肌微血管病变AGEs/RAGE轴及氧化应激的影响

许笑雯，储全根，2，储 俊，2，蔡正银，轩 云，罗宝璐，李 帅，陈 静，罗世旷，王悦琦

1安徽中医药大学，安徽 合肥 230038；2安徽中医药大学教育部新安医学重点实验室，安徽 合肥230038

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病常见的慢性并发症，是糖尿病患者死亡的重要原因［1］。心肌微血管病变是糖尿病心肌病的主要病理改变，因此探究糖尿病心肌微血管病变的中医治法，对防治DCM具有重要意义。糖尿病患者长期处于持续高糖环境下，经非酶糖基化反应在心肌微血管内皮和细胞外基质形成和沉积大量的晚期糖基化终末产物（AGEs），直接对心肌微血管内皮细胞产生不可逆的损害［2］。此外，AGEs与晚期糖基化终末产物受体（RAGE）结合，激活细胞内多条信号通路，引起氧化应激过度激活、炎症反应和蛋白激酶C活化等［3-5］，导致微血管内皮细胞损伤，AGEs与RAGE的相互作用在DCM的发病机制中具有重要作用，因此AGEs/RAGE轴的概念被学者提出［6］。

到目前为止，专门针对糖尿病心肌微血管病变的中医研究甚少，已报道的少量文献主要着眼于从“瘀”论治［7-9］，用化痰法或痰瘀同治法的研究尚未见报道，而根据糖尿病心肌微血管病变的发生机制和病理改变，符合中医“痰瘀阻络”病机，所以采用“痰瘀同治”更符合中医理论。课题组前期的体内动物实验研究发现，具有化瘀通络功效之抵当汤对DCM模型大鼠心肌组织微血管具有保护作用［10］，而将化瘀通络与化痰（痰瘀同治）相结合，以抵当陷胸汤为代表方，对糖尿病大鼠的心肌微血管和细胞外基质病变均具有更好干预作用［11］。本课题在前期研究基础上，通过体外高糖诱导心肌微血管内皮细胞（CMECs）损伤为模型进行研究，以具有痰瘀同治作用的抵当陷胸汤含药血清为干预手段，同时设置目前公认对AGEs及其交联结构有裂解作用的AGEs特异性蛋白交联抑制剂（ALT-711）［12］细胞干预制剂、具有化痰功效的小陷胸汤和化瘀通络功效的抵当汤含药血清作为对照，检测AGEs/RAGE轴及氧化应激相关指标，探讨痰瘀同治对高糖诱导损伤的CMECs的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

12周龄SPF级SD雄性大鼠50只，体质量180～220 g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，大鼠生产许可证编号：SCXK-（鲁）20190003。实验通过安徽中医药大学实验动物中心伦理审批（AHUCM-rats-2019014）。

1.2 药物

小陷胸汤：半夏10 g，黄连5 g，全瓜蒌30 g；抵当汤：虻虫10 g，水蛭10 g，制大黄10 g，桃仁15 g；抵当陷胸汤：虻虫10 g，水蛭10 g，制大黄10 g，桃仁15 g，半夏10 g，黄连5 g，全瓜蒌30 g。中药购于安徽中医药大学国医堂门诊部，按常规方法煎煮，浓缩至生药1 g/mL［13］。ALT-711，50 mg/支，批号：HY-106024B，Med Chem Express USA。

1.3 试剂与仪器

MTT检测试剂盒（贝博公司）；AGEs检测试剂盒（武汉基因美科技有限公司）；NAPDH-细胞色素c还原酶试剂盒（南京建成）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）；ROS 试剂盒（碧云天）；RIPA 细胞裂解液（Beyotime）；vWf（proteintech）;RAGE（Abcam）;山羊抗小鼠IgG（Zs-BIO）；山羊抗兔IgG（Zs-BIO）；Trizol（Life technogies）；电泳仪（型号：EPS300，上海天能公司）；荧光定量PCR 仪（型号：PIKOREAL 96，Thermo Scientific）；酶标仪（型号：RT-6000，雷杜公司）。

1.4 方法

1.4.1 含药血清制备 将50只雄性SD大鼠适应性喂养3 d，按随机数字表法将30只大鼠分成3组，10只/组，按剂量分别为4.0、4.05、8.10 g/kg的小陷胸汤、抵当汤和抵挡陷胸汤（按照体表面积法相当于临床成人等效量的10倍）［14］灌胃；其余20只大鼠予等体积的蒸馏水灌胃。灌胃2次/d，连续灌胃1周。末次灌胃1 h后，采用20%乌拉坦5 mL/kg麻醉，腹主动脉取血，静置后离心取血清，水浴灭活补体，过滤除菌后分装，分别制成各含药血清和空白血清，-80 ℃冻存备用。ALT-711直接采用细胞干预制剂，无需制备含药血清。

1.4.2 细胞分离、鉴定及培养 根据文献方法［15］，利用酶消化法从大鼠心脏中分离出原代CMECs，观察细胞生长状态，利用免疫荧光法鉴定是CMECs后，用10 mL含10%胎牛血清和1%双抗（青链霉素混合液）配制的细胞培养液重悬细胞，将重悬后的细胞接种在25 cm2的培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，传代备用。

1.4.3 MTT法筛选葡萄糖最佳造模浓度 取对数生长期的CMECs，消化离心后重悬，接种于96孔培养板中，过夜培养。设置不同浓度的葡萄糖：5.5、16.7、33、50 mmol/L，分别进行孵育24、48、72 h 后，弃去培养基，避光加入MTT溶液，放入培养箱中培养4 h；每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min，酶标仪A490nm处检测细胞存活率。

1.4.4 MTT法筛选含药血清对受损细胞的最佳保护浓度 将造模成功的CMECs接种于96板上，过夜培养后分别加入5%、10%、20%不同浓度的含药血清，分别培养24、48、72 h，检测方法同1.4.3。

1.4.5 实验分组与干预 根据MTT法筛选的最佳葡萄糖浓度对CMECs进行造模，将造模成功的CMECs进行消化、离心和悬重，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于6孔板，分成5组，模型组：培养基+5.5 mmol/L葡萄糖+空白血清；化痰组：培养基+5.5 mmol/L葡萄糖+10%小陷胸汤含药血清；化瘀组：培养基+5.5 mmol/L葡萄糖+10%抵当汤含药血清；痰瘀同治组：培养基+5.5 mmol/L葡萄糖+10%抵当陷胸汤含药血清；ALT-711组：培养基+5.5 mmol/L葡萄糖+ALT-711+空白血清。另设一组空白对照组，培养基+5.5 mmol/L葡萄糖+空白血清+正常CMECs。在培养箱中培养48 h后检测相关指标。

1.4.6 检测指标及方法

1.4.6.1 细胞AGEs 含量测定 采用ELISA 法检测AGEs的含量，通过反复冻融破坏细胞并释放出细胞内成分，3000 r/min 离心20 min，收集上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.4.6.2 细胞RAGE蛋白水平测定 免疫荧光法：待细胞生长融合到80%以上状态，将细胞收集好后用丙酮固定，加入0.5%TritonX-100溶液增加细胞膜通透性，予5%山羊血清封闭，孵育一抗（1∶200），4 ℃过夜，漂洗后加二抗（1∶400），37 ℃避光孵育1 h，再漂洗，滴加DAPI复染5 min，漂洗后制片，荧光显微镜下观察并拍照保存；Western blot法：收集细胞后，加入细胞裂解液于冰上裂解，离心后取上清液，BCA试剂盒测定总蛋白浓度。煮沸蛋白，配制凝胶，进行上样、电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。4 ℃孵育一抗（1∶1000）过夜，漂洗后予以二抗（1∶1000）室温下孵育2 h，再漂洗，参照ECL发光试剂盒说明书，在凝胶成像仪中曝光，拍照及图像分析。

1.4.6.3 RT-qPCR法检测细胞RAGE基因表达水平 用Trizol法提取细胞的mRNA，并测定其纯度，然后逆转录成cDNA，利用RT-qPCR试剂盒扩增目的基因。以βactin 为内参，β-actin 序列：正义5'-CCCATCTATGAG GGTTACGC-3'，反 义5'-TTTAATGTCACGCACGA TTTC-3'，扩增片段长度为150 bp；引物RAGE序列：正义5'-GAGCCTGGGTACTGGTTCTT-3'，反义5'-TCT GGGTTGGCTTCTTAGGG-3'，扩增片段长度为120 bp。反应程序为95°C预变性1 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火/延伸1 min，40个循环，然后进行60～95 ℃的熔解曲线分析，采用2-△△Ct法计算各组基因的相对表达水平。

1.4.6.4 细胞色素c还原法检测细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶活性 收集细胞并提取蛋白，严格按照试剂盒说明操作，分光光度计A550nm处检测细胞NADPH氧化酶活性水平。

1.4.6.5 二氢乙锭荧光探针检测细胞活性氧自由基（ROS）水平 收集细胞后，制成细胞悬液，调整细胞密度1×105/mL，接种于6孔板，加入1 mL浓度为5 μmol/L的DAF-FM-DA，37 ℃孵育箱内孵育20 min。用PBS洗涤细胞3次，将细胞置于激光共聚焦显微镜下观察。

1.5 统计学分析

采用SPSS23.0软件处理数据，计量资料用均数±标准差表示，采用单因素方差分析及组间多重比较，方差齐用LSD法，方差不齐用塔姆黑尼检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CMECs鉴定

在倒置显微镜下观察，贴壁细胞形态呈短梭形或多角形，细胞体积大小均匀，单层排列呈“铺路石样结构”，且血管性血友病因子（vWF）受血管床特异性途径的调节，可以作为具备内皮细胞独有的特征［16］。免疫荧光观察vWF蛋白为绿色，DAPI将细胞核染成蓝色，该细胞可以见鉴定为CMECs（图1）。

图1 CMECs鉴定Fig.1 Identification of CMECs (vWF factor detection)(Original magnification:×200).A:DAPI;B:vWF;C:Merge;D:Morphology.

2.2 MTT法筛选最佳造模浓度

随着葡萄糖浓度的增加，CMECs的活力逐渐降低，且呈时间依赖性。其中，33 mmol/L葡萄糖干预细胞48 h后存活率为49.10%（P<0.01），符合最佳造模条件（图2）。

图2 最佳造模条件Fig.2 Optimal conditions for cell modeling.**P<0.01 vs 5.5 mmol/L 24 h group.

2.3 MTT法筛选含药血清保护造模细胞的最佳百分比

将抵当陷胸汤含药血清对造模成功的CMECs进行干预，发现随着含药血清浓度的升高和作用时间的延长，细胞活力逐渐增加，其中10%含药血清作用48 h效果最好（P<0.01）。小陷胸汤含药血清与抵当汤含药血清亦在10%含药血清作用48 h效果最佳（P<0.01，图3）。

图3 含药血清最佳百分比Fig.3 Optimal percentage of drug-containing serum.A:Didang Decoction;B:Xiao Xianxiong Decoction;C:Didang Xianxiong Decoction.##P<0.01 vs normal CMECs group;**P<0.01 vs 0%medicated serum group.

2.4 CMECs的AGEs含量

MC 组细胞内AGEs 含量明显高于NC 组（P<0.01）；各治疗组的AGEs 含量较MC 组显著减少（P<0.01），其中痰瘀同治组（RPDBS）组较化痰组（RP）与化瘀组（DBS）效果好（P<0.01），RPDBS组和ALT-711组的AGEs含量下降效果差异无统计学意义（P>0.05，图4）。

图4 CMECs内AGEs的含量Fig.4 Content of AGEs in CMECs.A:NC group;B:MC group;C:RP group;D:DBS group;E:RPDBS group;F:ALT-711 group.##P<0.01 vs NC;**P<0.01 vs MC;▲▲P<0.01 vs RPDBS.

2.5 CMECs的RAGE蛋白和基因表达水平

免疫荧光结果显示，DAPI 将细胞核染成蓝色，RAGE蛋白染成绿色。结合Western blot法和RT-qPCR法检测结果，与NC组对照，MC组RAGE蛋白和基因表达水平升高（P<0.01）；经各种治疗干预后，RAGE蛋白和基因表达水平降低（P<0.01）；中药治疗中，RPDBS组的RAGE蛋白和基因表达水平下降最显著（P<0.01，P<0.05），与ALT-711组效果相当（P>0.05，图5～7）。

图5 CMECs的免疫荧光结果Fig.5 Immunofluorescence results of CMECs (×20).A:NC group;B:MC group;C:RP group;D:DBS group;E:RPDBS group;F:ALT-711 group.

图6 CMECs的RAGE蛋白表达水平Fig.6 RAGE protein expression in CMECs.A:NC group;B:MC group;C:RP group;D:DBS group;E:RPDBS group;F:ALT-711 group.##P<0.01 vs NC;**P<0.01 vs MC;▲▲P<0.01,▲P<0.05 vs RPDBS.

图7 CMECs的RAGE基因表达水平Fig.7 RAGE mRNA expression levels in CMECs.A:NC group;B:MC group;C:RP group;D:DBS group;E:RPDBS group;F:ALT-711 group.##P<0.01 vs NC;**P<0.01 vs MC;▲▲P<0.01 vs RPDBS.

2.6 CMECs的NADPH氧化酶活性

与NC组比较，MC组的CMECs经过高糖诱导后NADPH 氧化酶活性显著升高（P<0.01）；各治疗组较MC组NADPH氧化酶活性水平降低（P<0.01）；中药治疗组中，RPDBS组的效果最好（P<0.01）；RPDBS组和ALT-711组NADPH氧化酶活性水平下降效果相当（P>0.05，图8）。

图8 CMECs的NADPH氧化酶活性Fig.8 Oxidase activity level of NADPH in CMECs.A:NC group;B:MC group;C:RP group;D:DBS group;E:RPDBS group;F:ALT-711 group.##P<0.01 vs NC;**P<0.01 vs MC;▲▲P<0.01 vs RPDBS.

2.7 CMECs的ROS活性水平

与NC组比较，MC组ROS活性水平明显升高（P<0.01）；经各种治疗干预后ROS活性水平均降低（P<0.01）；其中RPDBS组较RP组效果好（P<0.01），与DBS 组及ALT-711组效果相当，差异无统计学意义（P>0.05，图9）。

图9 CMECs的ROS活性水平Fig.9 Activity level of ROS in CMECs.A:NC group;B:MC group;C:RP group;D:DBS group;E:RPDBS group;F:ALT-711 group.##P<0.01 vs NC;**P<0.01 vs MC;▲▲P<0.01 vs RPDBS.

3 讨论

心肌微血管病变是DCM主要病理改变，主要表现为微血管基底膜增厚、微血管瘤形成和微血管循环发生障碍等。CMECs在调节血管舒缩、控制血管通透性和调节凝血与抗凝之间的平衡中发挥着重要作用，因此又可将其视为微血管的保护屏障［17］，与糖尿病心肌病、高血压、冠心病等心血管疾病的发生密切相关。课题组前期动物体内实验研究结果［10,11,18,19］证明抵当陷胸汤对糖尿病心肌微血管病变有一定的防治作用。本实验建立体外高糖诱导CMECs损伤模型，以具有痰瘀同治功效的抵当陷胸汤含药血清为干预手段，着眼于痰瘀阻络的基本病机。结果发现，在浓度为33 mmol/L的高糖环境下，采用10%抵当陷胸汤含药血清干预受损的CMECs 48 h后，细胞活力改善情况最佳，说明具有痰瘀同治功效的含药血清对高糖诱导的CMECs有保护作用。

AGEs是经非酶糖基化反应后形成的不可逆性病理产物，被认为是引起糖尿病血管病变的重要物质，主要通过直接和间接两种途径发挥其生物学效应，是糖尿病微血管病变的重要始动环节［20］。RAGE是多种配体的跨膜蛋白，是介导AGEs对于心血管系统损伤的主要受体，与AGEs结合后可激活细胞内多条信号通路，发生一系列细胞内氧化应激、炎症反应等，最终导致微血管内皮损伤［21］。体内诸多细胞，如内皮细胞、血管平滑肌细胞和肾小球上皮细胞表面都有RAGE受体的表达［22］，可知CMECs是研究AGEs/RAGE信号通路的重要靶细胞。已有研究表明［23］，在高糖环境下RAGE高表达。在本研究中，我们使用RT-qPCR、Western blot及免疫荧光实验发现，MC组的CMECs中RAGE的基因和蛋白表达水平与NC组相比均显著升高；ELISA检测实验发现，MC组的AGEs含量显著增加。经中药含药血清干预后，上述指标均下降，结果提示中药含药血清可能对AGEs/RAGE信号轴具有抑制作用。

氧化应激是糖尿病及其并发症发生、发展的关键因素［24-25］。体内活性氧簇（ROS）是生物有氧代谢过程中产生的副产物，生理状态下少量的ROS可调节细胞的增殖、分化、迁移和细胞凋亡等生理过程［26］，细胞内的NADPH是ROS的重要来源。研究发现［27］，高糖环境下随着AGEs含量不断累积，可伴有葡萄糖和Amadori 产物的自氧化而产生ROS，而且ROS 的增加也能促进AGEs 的生成。亦有文献报道［28］，细胞AGE-RAGE信号通路的激活可以提高NADPH氧化酶活性，促进ROS产生。此外，AGEs-RAGE信号通路衍生的ROS可以与NADPH氧化酶相互作用以进一步促进ROS的合成，并且NADPH 氧化酶衍生的ROS 在正反馈回路中与AGEs-RAGE衍生的ROS具有相同的作用。CMECs中ROS激增，破坏细胞氧化还原动态平衡，氧化应激过度激活，经级联反应诱导细胞凋亡、变性坏死，加重微血管病变。本研究结果提示，MC组的NADPH氧化酶活性以及ROS活性水平与NC组相比均显著升高，各含药血清组较MC组均显著降低，说明含药血清可能通过抑制AGEs/RAGE信号轴从而抑制氧化应激，对CMECs起保护作用。

中医学将糖尿病微血管病变归属于“络病”，其病理变化属于“络脉瘀阻”。因AGEs本身具有“痰浊”的特点，通过受体和非受体两种途径导致微血管内皮细胞受损、基底膜增厚以及细胞外基质胶原沉积和纤维化等，造成气血运行不畅或闭阻，又形成“瘀阻”，从而形成“痰瘀互结”的病机，故考虑以痰瘀同治法为防治原则。抵当汤与小陷胸汤均出自《伤寒杂病论》，抵当汤由破血逐瘀通络之水蛭、虻虫及活血化瘀泻下之桃仁、大黄组成，具有化瘀之功；小陷胸汤由宽胸化痰之全瓜蒌、化痰散结之半夏及清热燥湿之黄连组成，具有化痰宽胸之功；两方合用具有痰瘀同治之效，故作为痰瘀同治之代表方。

瓜蒌皮提取物通过抑制氧化应激来延缓人脐静脉内皮细胞衰老［29］；黄连素通过降低AGEs的含量、抑制氧化应激来改善早期糖尿病肾病患者血管内皮功能［30］；水蛭冻干粉可以降低糖尿病肾病大鼠体内超氧化物歧化酶活性和丙二醛，抑制氧化应激，改善肾功能［31］；大黄酸可以下调还原性辅酶Ⅱ基因表达，通过抑制氧化应激对糖尿病大鼠肾脏产生保护作用［32］。本研究发现，3组中药含药血清均能降低造模成功的CMECs中AGEs含量、RAGE 蛋白和基因表达、NADPH 氧化酶活性及ROS活性水平，可能与方药中的黄连、大黄、水蛭及瓜蒌等有效成分降低氧化应激的作用有关。在降低AGEs含量、RAGE 蛋白和基因表达和NADPH 氧化酶活性中，抵当陷胸汤较其拆方效果好，提示可能中药合方抑制AGEs/RAGE信号轴、降低氧化应激的作用大于中药单体。而在降低ROS活性水平指标方面，抵当陷胸汤效果虽较小陷胸汤好，但与抵当汤无显著性差异。在对上述指标的干预方面，抵当陷胸汤总体上与ALT-711组效果相当，差异无统计学意义。

综上所述，痰瘀同治法可能通过抑制AGEs/RAGE信号轴，进而抑制氧化应激过度激活，从而保护心肌微血管内皮细胞，且痰瘀同治法优于单独化痰法和单独化瘀法。