抑制Notch1/Jagged1通路可促进大鼠骨髓间充质干细胞“归巢”并改善哮喘

王 坤，朱慧志，杨 磊，徐晴雯，任冯春，刘向国

1 新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230031；2 徽学研究中心安徽中医药大学分中心，安徽 合肥 230031；3 安徽中医药大学中医学院，安徽 合肥 230012；4 安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；5安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；6安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥230012

支气管哮喘是由多种细胞及细胞组分参与的气道免疫炎症性疾病［1-2］，其中辅助T细胞Th1/Th2“漂移”在哮喘炎症的发生发展中起重要作用［3-4］。Th1/Th2间维持动态平衡是机体应对外界刺激的基本免疫调节方式［5］。哮喘作为一种免疫疾病，在过敏原刺激下其发病以Th1/Th2间平衡向Th2“漂移”，形成炎症反应为主要特征［6］。积极有效地调控Th1/Th2“漂移”是治疗哮喘的重要手段。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是骨髓中的成体干细胞［7］。既往研究发现［8-9］，BMSCs驱动的免疫调节可重新调控Th1/Th2平衡，减少Th2细胞因子，抑制嗜酸性粒细胞在肺组织的聚集，降低哮喘炎症损伤。这一过程的前提是“归巢”：组织发生炎症损伤时，BMSCs向受损部位迁移。归巢能在靶向部位发挥免疫效应。BMSCs归巢对哮喘中的免疫失衡虽有调节作用，但具体作用机制尚不明确。Notch信号通路广泛参与细胞发育、分化及免疫调节等功能活动［10］。Notch 受体（Notch1等）和配体（Jagged1等）结合后，其胞内段易位至细胞核，与DNA结合转录阻遏物结合并作用，将其转化为诱导靶基因转录的转录激活复合物，活化下游靶基因的表达［11］。Notch 通路中的受体Notch1 和配 体Jagged1 是哮喘Th1/Th2 平衡向Th2“漂移”的关键因素。研究表明［12-13］，Jagged1蛋白参与了Th2细胞的发育，而Notch1通过促进Th2特异性转录因子GATA-3的表达，诱导Th2细胞分化。BMSCs归巢与Notch通路均与哮喘Th1/Th2“漂移”关系密切，其中可能存在更深入的关联。为进一步观察Notch 通路是否参与哮喘BMSCs归巢过程，本文拟通过阻断Notch信号通路研究BMSCs归巢对哮喘Th2型炎症反应的调节及归巢与Notch1/Jagged1通路的关联性。旨在推测Notch信号通路可能参与了Th1/Th2“漂移”和BMSCs归巢免疫调节，从而改善哮喘炎症反应。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级雄性SD 大鼠（20 只，体质量180～200 g），用于实验分组。4周龄清洁级雄性SD大鼠（10只，体质量80～100 g）用于骨髓间充质干细胞及哮喘支气管上皮细胞提取。以上大鼠均由安徽医科大学实验动物管理中心提供。动物伦理由安徽中医药大学动物伦理委员会批准（批号：AHUCM-rats-2019005）。

1.1.2 主要设备和试剂 显微镜（OLYMPUS）；超声雾化器（上海鱼跃医疗设备股份有限公司）；荧光定量PCR仪（Thermo）。流式细胞仪（贝克曼）。卵清蛋白（OVA）：V级（Sigma）；酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（Invitrogen）；角蛋白8（keratin 8）抗体（Abcam）。CD29-异硫氰基荧光素（FITC）、CD45-FITC、CD44-藻红蛋白（PE）、CD11b/c-PE单克隆抗体（eBioscience）。PCR试剂盒（赛默飞）；趋化因子受体4抗体（Proteintech）；Cy3标记山羊抗兔IgG（H+L）（Beyotime）；T-bet、GATA-3、Notch1、Jagged1抗体（Santa Cruz）。

1.2 方法

1.2.1 分组 将20只大鼠用随机数字表法分为正常对照组（NC）、模型对照组（MC）、BMSCs移植组（BMSCs）、BMSC+Notch抑制剂组，5只/组。

1.2.2 间充质干细胞的分离、培养、鉴定 4周龄大鼠断颈处死后，取股骨并剪去两端，吸取胎牛血清+双抗溶液多次冲出骨髓细胞后吹打，1000 r/min离心5 min，弃上清，用PBS 重悬细胞，以2×106/cm2密度接种，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养。每3～4 d更换1次培养基。原代细胞融合至80%～90%左右开始传代培养，调整细胞浓度至1×106/mL，倒置显微镜下观察细胞形态。取融合达90%的第4代BMSCs，分别加入荧光标记的抗体（Anti-CD29-FITC、Anti-CD44-PE、Anti-CD45-FITC、Anti-CD11b/c-PE），混匀，4 ℃避光孵育30 min，PBS漂洗2遍以去除未结合的抗体，流式细胞仪鉴定其表面标志物。

1.2.3 CFSE标记BMSCs 将荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺（CFSE）以DMSO溶解，配成使用液，贮存于4 ℃条件下，避免反复冻融。移植前将5×106BMSCs细胞悬浮于2 mL 0.1%BSA/PBS 内，加入2 μL CFSE工作液，置37 ℃10 min；4倍体积4 ℃的胎牛血清终止反应，室温5 min；PBS室温洗涤3次，第2次结束后37 ℃5 min；将1×106BMSCs细胞悬浮于1 mL PBS内，备用于移植。

1.2.4 哮喘模型建立［14］及细胞移植 除正常对照组外的各组大鼠，在第0和7天腹腔注射致敏混合液（含1 mg 10%卵清蛋白和100 mg氢氧化铝凝胶），第14天将大鼠置于密闭容器内，予1%卵清蛋白雾化激发，30 min/次，1次/d，连续7 d。正常组予生理盐水替代完成上述操作。BMSCs组及BMSCs+Notch抑制剂组在激发最后一天经尾静脉将CFSE标记的1×106/mL BMSCs悬液植入体内，其余2组以PBS替代注射。BMSCs+Notch抑制剂组在激发前1 h按1 mg/kg体质量腹腔注射抑制剂，隔日1次，连续7 d。

1.2.5 哮喘支气管上皮细胞的分离及鉴定 大鼠麻醉后在无菌环境下取出气管，清除肺组织及表面其他软组织后，灌入1%链酶蛋白酶，结扎上端，4 ℃过夜，置于90 mm培养皿中，剪开气管,予培养基冲洗，细胞刷充分刷洗，收集培养皿中的刷洗液，离心洗涤收集细胞。1000 r/min离心5 min，弃上清，用原代细胞培养液吹打细胞后置于无菌培养瓶，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，备用于实验。各组分离培养获得的支气管上皮细胞与角蛋白单克隆抗体作用后，经细胞核荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗，置于荧光显微镜下观察。

1.3 观察指标

1.3.1 间充质干细胞归巢至肺组织观察 在BMSCs移植后24、72、144 h取大鼠肺组织，将组织剪成1～2 mm3小块，用消化酶消化，不锈钢过滤网过滤消化液，调整各组全肺单个细胞悬液浓度，采用流式细胞术和荧光显微镜分析CFSE-BMSCs（绿色）荧光强度。

1.3.2 支气管上皮细胞CXCR4表达检测 采用免疫荧光检测支气管上皮细胞CXCR4表达。将分离培养获得的支气管上皮细胞传代，待长至80%～90%经PBS洗涤、胰酶消化，充分吹打成单细胞悬液，接种于已置玻片的6孔板。爬片以4%多聚甲醛避光固定，滴加5%BSA均匀覆盖。经CXCR4抗体（1∶100），Cy3标记山羊抗兔IgG（H+L）（1∶500）作用后，予以DAPI染色，封片，置于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330～380 nm，发射波长420 nm，发蓝光；CY3激发波长510～560 nm，发射波长590 nm，发红光）。

1.3.3 肺组织病理形态学观察 取大鼠右下肺组织，石蜡包埋，HE染色，光学显微镜下观察肺组织病理形态学变化。

1.3.4 哮喘大鼠肺组织Th1/Th2细胞表达 检测各组大鼠肺组织IFN-γ、IL-5、IL-13的蛋白水平，操作方法按照美国Invitrogen的ELISA试剂盒操作步骤，用酶标仪测定并计算各组蛋白含量。

1.3.5 肺组织Notch1/Jagged1通路相关基因表达 提取大鼠肺组织总mRNA，Notch1、Jagged1引物设计由上海生工合成（Notch1、Jagged1引物序列见表1）。反转录试剂盒反转录第一链互补DNA（cDNA），PCR扩增，扩增产物进行1.5%琼脂糖电泳，UVP凝胶显像仪扫描，图像分析。以β-actin作为内源参照，使用2-ΔΔCT方法计算Notch1、Jagged1 mRNA的相对表达量。

表1 Notch1、Jagged1引物序列Tab.1 Primer sequences of Notch1 and Jagged1

1.3.6 肺组织T-bet、GATA-3、Notch1、Jagged1蛋白表达将肺组织在冷的组织裂解缓冲液中均匀化、溶解，提取肺组织总蛋白。将样品放入标准蛋白样品缓冲液中煮沸，用10%三甘氨酸凝胶进行蛋白电泳，然后转移至聚偏二氟乙烯膜膜。将膜依次加入T-bet、GATA-3、Notch1、Jagged1一抗（稀释浓度分别为1∶1000、1∶1000，1∶800、1∶1000）、二抗（山羊抗兔IgG，上海碧云天生物技术有限公司，A0516）孵育，稀释浓度为1∶5000，按照标准规程对膜进行显影。使用发光试剂盒检测试剂对这些条带进行曝光、显影。Image J量化各个条带的强度，并以相对于内参β-actin的百分比表示T-bet、GATA-3、Notch1、Jagged1蛋白表达量。

1.4 统计学分析

采用SPSS19.0统计软件对数据进行统计分析，结果用均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞、支气管上皮细胞鉴定骨髓间充质干细胞观察及鉴定

初次接种2 h后开始贴壁，细胞呈类圆形，密集分布，排列无序。原代培养7 d后，细胞开始增殖，形态呈锤形或梭形。第3代未分化间充质干细胞，形态均一呈成纤维细胞样，漩涡状分布，排列整齐有序。流式细胞仪分析发现，BMSCs表面标志物CD29、CD44呈阳性，表达量分别为97.4%、96.5%。CD45、CD11b呈阴性，表达量分别为1.62%、1.08%（图1）。支气管上皮细胞鉴定：经DAPI染色后细胞核呈蓝色荧光，支气管上皮细胞特异性目的蛋白keratin 8的抗体表达于胞浆，呈红色荧光，鉴定为支气管上皮细胞（图2）。

图1 BMSCs表面标志物CD29、CD44、CD45、CD11b表达Fig.1 Expression of BMSC surface markers CD29,CD44,CD45 and CD11b.

图2 支气管上皮细胞鉴定Fig.2 Identification of bronchial epithelial cells (Immunofluorescence staining,original magnification:×200).A:The nuclei of bronchial epithelial cells were blue after DAPI staining;B:The cytoplasm showed red fluorescence;C:Merged image.

2.2 骨髓间充质干细胞归巢至肺组织观察

通过将CFSE标记BMSCs移植至哮喘大鼠体内，追踪CFSE表达量来反映BMSCs在肺组织中的归巢程度。流式细胞术观察肺组织CFSE表达量发现，BMSCs体内移植后，24 h CFSE表达量为（4.89±1.65）%，72 h CFSE表达量为（14.78±4.65）%，144 h CFSE表达量为（3.07±1.06）%，CFSE在肺组织表达量随着时间推移逐渐升高，在72 h 达到高峰，后逐渐降低，证明移植后BMSCs可向肺组织归巢，表明同源异体BMSCs经尾静脉注射入哮喘大鼠体内后可向肺组织迁移（图3）。

图3 CFSE标记的BMSCs在哮喘大鼠肺组织中表达Fig.3 Expression of CFSE-labeled BMSCs in lung tissues of asthmatic rats.A:Homing amount of CFSE+cells at 24 h.B:Homing amount of CFSE+cells at 72 h.C:Homing amount of CFSE+cells at 144 h.D:Comparison of CFSE expression across the time points.**P<0.01 vs 24 h;▲▲P<0.01 vs 72 h.

2.3 支气管上皮细胞中CXCR4表达

NC组与MC组之间比较，MC组CXCR4表达量较NC 组升高（t=2.8271、P=0.0222）。BMSCs 移植及Notch 抑制剂干预后发现，与NC 组、MC 组比较，BMSCs组、BMSCs+Notch抑制剂组CXCR4表达量均显著升高（t=2.6021、P=0.0315，t=5.8649、P=0.0004）。与BMSCs组比较，BMSCs+Notch抑制剂组CXCR4表达量升高（t=3.254、P=0.0116，图4）。

图4 支气管上皮细胞中CXCR4表达Fig.4 CXCR4 expression in bronchial epithelial cells (immunofluorescence staining,×200).A:NC group;B:MC group;C:BMSCs group;D:BMSCs+Notch inhibitor group;E:Comparison of relative expression of CXCR4 among the groups.*P<0.05,**P<0.01 vs NC group;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01 vs MC group;▲P<0.05 vs BMSCs.

2.4 肺组织病理形态学观察

NC组大鼠肺组织结构完整，支气管管腔无狭窄，管腔壁无增厚紊乱，周围无明显炎症细胞浸润。MC组大鼠肺组织结构受损明显，支气管管腔狭窄，平滑肌增生明显，周围大量炎症细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主，成团聚集。BMSCs组及BMSCs+Notch抑制剂组肺组织受损、管腔狭窄及炎症细胞浸润情况均较模型组有不同程度减轻（图5）。

图5 各组大鼠肺组织病理形态学观察Fig.5 Observation of pathologies of rat lung tissue in each group (HE staining,×200).A:NC group;B:MC group;C:BMSCs group;D:BMSCs+Notch inhibitor group.

2.5 肺组织Th1、Th2细胞因子表达

ELISA结果显示，与NC组比较，MC组IFN-γ表达降低（t=5.2001、P=0.0008），IL-5、IL-13表达升高（t=4.2173、P=0.0029，t=3.7989、P=0.0052）。

与MC组比较，BMSCs组、BMSCs+Notch抑制剂组IFN-γ表达升高（t=2.653、P=0.0291，t=5.4014、P=0.0006）；BMSCs+Notch抑制剂组IL-5、IL-13降低（t=2.5386、P=0.0348，t=3.7295、P=0.0058）。BMSCs组IL-5（t=1.8189、P=0.1064）、IL-13（t=1.1298、P=0.2913）表达降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。

与BMSCs组比较，BMSCs+Notch抑制剂组IFN-γ表达升高（t=2.7269、P=0.0260），IL-13降低（t=2.9032、P=0.0198，表2）。

表2 肺组织Th1/Th2细胞表达Tab.2 IFN-γ,IL-5 and IL-3 expressions in the lung tissue(Mean±SD,pg/mL,n=5)

表3 肺组织Th1、Th2细胞特异性转录因子蛋白表达Tab.3 Expression of Th1 and Th2 cell-specific transcription factor proteins in the lung(Mean±SD,n=5)

2.6 肺组织Th1、Th2细胞特异性转录因子蛋白表达

免疫印迹结果显示，与NC组比较，MC组肺组织Th1 细胞特异性转录因子T-bet 蛋白表达降低（t=5.3118、P=0.0007），Th2细胞特异性转录因子GATA-3蛋白表达升高（t=5.9062、P=0.0004）。经BMSCs移植及Notch1 通路阻滞剂后，与MC 组比较，BMSCs 组、BMSCs+N抑制剂组T-bet蛋白表达升高（t=4.2132、P=0.0029，t=5.9316、P=0.0003），BMSCs组、BMSCs+N抑制剂组GATA-3 蛋白表达降低，但无统计学意义（P>0.05，表4，图6）。

图6 肺组织Th1、Th2细胞特异性转录因子蛋白表达Fig.6 Th1 and Th2 cell specific transcription factor protein expression in lung tissue.

2.7 肺组织Notch1/Jagged1表达

RT-PCR 检测结果显示，与NC 组比较，MC 组Notch1、Jagged1 mRNA和蛋白表达升高（P<0.01）。与MC组比较，BMSCs组Notch1、Jagged1 蛋白表达降低，BMSCs+Notch抑制剂组Notch1、Jagged1mRNA和蛋白表达降低（P<0.05或P<0.01）。与BMSCs组比较，BMSCs+Notch抑制剂组Notch1mRNA表达降低（P<0.05，表5，图7）。

图7 肺组织Notch1、Jagged1蛋白表达Fig.7 Expression of Notch1 and Jagged1 protein in lung tissue.

表5 肺组织Notch1/Jagged1表达Tab.5 Expression of Notch1/Jagged1 in lung tissue(Mean±SD,n=5)

3 讨论

哮喘作为免疫相关的疾病，是以Th1/Th2失衡诱发的Th2型免疫炎症占主导［15］。骨髓反应机制参与了哮喘炎症的发生发展。在过敏原刺激下，Eos/B祖细胞自骨髓释放量增多，经外周循环周转至肺，在Th2细胞因子IL-4、IL-5等调控下分化成熟，出现以嗜酸性粒细胞气道浸润为主的哮喘病理变化［16-17］。哮喘气道炎症反应是多种炎症细胞及细胞组分相互作用的结果［18］。过敏原刺激下，细胞免疫调节功能下降，导致Th1/Th2平衡向Th2“漂移”，Th1细胞因子（IFN-γ等）分化受抑制，Th2炎症因子（IL-5、IL-13等）大量产生，通过促进肥大细胞募集，IgE合成，嗜酸性粒细胞浸润等方式，促进哮喘炎症反应的发生发展［19-20］。本研究结果显示，与NC组比较，MC组IFN-γ表达降低，IL-5、IL-13表达升高。而Th1、Th2转录因子亦随之变化，同时大量Th2型炎性因子分化并对相关炎症介质的调控作用，致使慢性气道炎症发生及加剧。此研究结果与Abdolreza等［21］的研究结果相似。

源于骨髓的间充质干细胞具有多向分化能力，增殖性高且具有良好的免疫调节性和免疫相容性。BMSCs通过调节免疫炎症可有效改善哮喘［22］。哮喘发作时，BMSCs通过调节树突状细胞和T细胞功能，抑制相关炎症细胞的分泌，发挥免疫调节剂的作用［23］。本次研究发现，将间充质干细胞注射入哮喘大鼠体内后，支气管上皮细胞中CXCR4表达随之升高，且肺组织病理形态学改善。说明BMSCs可有效缓解哮喘炎症损伤。而改善的前提是“归巢”，“归巢”使得骨髓中休眠的BMSCs被炎症损伤部位分泌的趋化因子“唤醒”，迁移至受伤的肺组织，免疫调节炎症环境和修复受损肺组织，从而改善哮喘症状。Th1/Th2“漂移”即Th2型反应模式是哮喘气道炎症的重要特征，也是哮喘炎症形成的始动和维持因素。BMSCs具有免疫相容性和免疫调节的特征［24］。免疫相容性使得BMSCs不易被机体的免疫细胞识别，有效逃脱免疫系统的攻击排斥，为异体应用提供可能［25］。本研究发现，经BMSCs 干预后，BMSCs 组、BMSCs+Notch抑制剂组IFN-γ表达升高，IL-5、IL-13表达降低。提示在机体出现炎症反应时，受损部位释放趋化因子与

BMSCs表面的趋化因子受体（CXCR4）结合，沿着趋化轴，BMSCs归巢至炎症损伤部位，调节免疫内环境，发挥抑制炎症和组织修复作用，从而改善哮喘大鼠肺组织病理形态学变化。研究表明［26］，在哮喘的炎症反应中，BMSCs可通过分泌和调节生长因子、细胞因子、抗纤维化因子等实现旁分泌效应，抑制T细胞的过度活化，改变Th1/Th2平衡，缓解哮喘气道炎症。

Notch信号通路广泛参与多种组织细胞的信号识别、增殖、分化和凋亡等功能活动［27］。在哺乳动物中，Notch通路由Notch配体和Notch受体组成，它们都是I型跨膜蛋白［28］。受体与配体结合，在受体Jagged1触发后由γ-分泌酶介导的蛋白水解机制释放Notch胞内域（NICD），通过与DNA 结合蛋白（DNA 结合转录阻遏物）关联介导了Notch信号的传导［29］。这种蛋白质-蛋白质间的相互作用可激活下游的基因［30］。Notch信号通路参与了对BMSCs的调控。有研究发现［31］，Notch信号通路可抑制间充质干细胞向成骨细胞转化。用Jagged1处理BMSCs后，BMSCs中下游的基因mRNA水平显着增加，BMSCs中的白蛋白表达被阻断。研究还发现［32］，通过γ-促分泌酶抑制剂阻断Notch 信号传导或敲除BMSCs 中Notch 信号的转录因子RBP-J 可导致CXCR4表达上调，并促进BMSCs在体外和小鼠肝脏缺血/再灌注模型体内肝脏组织中对SDF-1的反应，说明通过阻断Notch信号传导可上调BMSCs中的CXCR4表达以达到增强BMSCs归巢能力的目的。本次研究结果显示，与NC组比较，MC组Notch1mRNA、Jagged1mRNA表达升高，Notch1、Jagged1蛋白表达升高。说明哮喘发生时存在Notch信号通路受体和配体表达的变化。而通过BMSCs 植入归巢后发现，BMSCs 组、BMSCs+Notch抑制剂组Notch1mRNA、Jagged1mRNA表达降低，且BMSCs+Notch抑制剂组Jagged1蛋白降低更明显，说明抑制Notch通路过激活可促进BMSCs归巢，从而影响哮喘的进展。

综上所述，哮喘存在Th1/Th2平衡向Th2“漂移”，且BMSCs向哮喘肺组织归巢对Th1/Th2“漂移”产生调节作用，而Notch1/Jagged1通路可能参与其过程，通过抑制Notch1/Jagged1通路过激活可改善哮喘炎症的发作。