猕猴桃花粉液体培养方法的优化

钱峥，姚春潮

（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100）

猕猴桃（Actinidia）为猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia Lindl.）雌雄异株落叶藤本果树，授粉是猕猴桃果实产量及品质形成的前提和保证。自然授粉对猕猴桃的授粉效果而言相对不稳定，因此，人工辅助授粉技术成为猕猴桃充分授粉的重要保障措施。液体授粉在操作上省时省力，高效便捷，适合大面积快速授粉，对提高授粉作业效率和坐果率具有明显优势。花粉液体培养配方是决定猕猴桃液体授粉效果及作业效率的关键条件。大量研究表明，碳水化合物的存在对花粉的生活力有显著的促进作用，其中使用最多的是蔗糖[1-3]。适宜浓度的糖在花粉培养基中主要起到的作用：一是保持花粉内外渗透压；二是为花粉萌发提供营养，并促进花粉管的伸长[4]。硼酸和钙对花粉的萌发和花粉管的伸长也有一定的促进作用[5]。稳定剂作为花粉液体培养配方中的重要组分，起到使花粉均匀分散在液体中，并保证花粉液不易产生沉淀的作用。适宜种类及浓度的稳定剂有助于保持液体授粉作业过程中花粉液的均匀，使喷口不易被堵塞，保证授粉效果良好。因此，研究花粉液体培养配方中稳定剂组分，为优化花粉培养方法及猕猴桃生产的提质增效提供一定的技术支撑。

1 材料与方法

本试验在眉县西北农林科技大学猕猴桃试验站进行。所用花粉材料均为“佰瑞”牌商品花粉，将花粉置于-20℃冰箱中冷冻保存，使用前24h 提前取出，置于4℃条件下以恢复其活性。

在不同黄原胶（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L）（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L）、海藻酸钠和羧甲基纤维素钠（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L）浓度的液体培养基上进行花粉离体萌发试验，以10%蔗糖+0.1g/L H3BO3+1.0 g/L 花粉+纯水+温度25℃为对照组，在对照组的基础上，研究添加各稳定剂不同浓度对花粉萌发率的影响，分别获得各稳定剂对花粉液体培养最适宜的浓度。将配制好的各处理花粉培养液分别装入10mL 离心管中摇匀，每一支离心管装入7mL 花粉培养液，置于设定温度25℃、转速100rpm 的恒温摇床中培养2h，取出后将花粉液样品置于光学显微镜下进行观察，统计萌发花粉粒及全部花粉粒的数量，花粉管长度大于花粉粒直径作为已萌发花粉粒，计算花粉萌发率[6]。每个处理重复3 次。

花粉悬浮效果的测定采用血球计数法，以10%蔗糖+0.1g/L H3BO3+1.0 g/L 花粉+纯水为对照组，在此基础上，研究添加不同种类及浓度稳定剂对花粉悬浮效果的影响。将配制好的花粉培养液分别装入5 支10mL离心管中摇匀，每支离心管装入7mL 花粉培养液，分别在常温下静置0min、30min、60min、90min、120min，将静置各时间段后的离心管中间部位的花粉培养液，滴入25×16 格血球计数板，置于光学显微镜下进行观察，统计花粉粒个数，计算1mL 液体中的花粉总数[6]。每个处理重复3 次。

根据添加以上稳定剂的花粉培养液的悬浮效果及萌发率的单因素试验，设计正交试验，确定最适花粉培养液稳定剂复配比例。

本试验的数据使用Microsoft Excel 2016 进行数据整理，使用IBM SPSS Statistics 26 数据处理系统进行方差分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同稳定剂种类及浓度对花粉萌发率的影响

由表1 可知，3 种稳定剂对花粉萌发率的影响不一致。总体而言，无论浓度的高低，黄原胶对保持花粉萌发率的效果最好，不同黄原胶浓度处理对花粉萌发率的影响与对照组差异不显著。海藻酸钠在较低浓度时（0.1g/L、0.2g/L）对花粉萌发率的影响与对照组相比差异不显著，但在高于0.3g/L 的浓度下则会显著降低花粉萌发率。羧甲基纤维素钠与海藻酸钠对花粉萌发率的影响较为相似，在较低浓度时对萌发率的影响与对照组相比不显著，而随着浓度的增加则显著抑制花粉的萌发。0.2g/L 黄原胶处理的花粉萌发率最高，为55.59%。

2.2 不同稳定剂种类及浓度对花粉悬浮效果的影响

由表1 可知，不同种类稳定剂对花粉培养液的稳定效果存在显著差异。稳定剂浓度为0.4g/L 时，黄原胶作为稳定剂的花粉培养液在静置120min 后的花粉浓度比例为21.21%，海藻酸钠作为稳定剂的花粉培养液在静置120min 后的花粉浓度比例为26.47%，羧甲基纤维素钠处理的花粉浓度比例则为41.18%。相同浓度的以上3 种稳定剂，悬浮效果最好的是羧甲基纤维素钠，其次为海藻酸钠，最后是黄原胶。随着黄原胶浓度的增大，花粉浓度比例随静置时间的变化而提高，有效提高了花粉培养液的稳定性，当黄原胶浓度为1.0g/L 时，静置120min 后的花粉浓度比例达到75%。花粉培养液的稳定性随着海藻酸钠和羧甲基纤维素钠浓度的升高而提高，在浓度为0.5g/L 时，两者静置120min 后的花粉浓度比例分别为39.39%和46.88%。

表1 不同稳定剂种类及浓度对花粉萌发率和悬浮效果的影响

2.3 复配稳定剂的确定

根据复配稳定剂正交试验结果（见表2）可知，3 种稳定剂对花粉萌发率的影响主次顺序为B＞C＞A，即羧甲基纤维素钠＞海藻酸钠＞黄原胶。根据保证最佳花粉萌发率的原则，选用最优复配稳定剂方案为A1B1C1，即黄原胶0.8g/L、羧甲基纤维素钠0.1g/L、海藻酸钠0.1g/L。

表2 复配稳定剂L9（33）正交试验结果及极差分析

3 讨论与结论

在花粉培养液中添加稳定剂时，首先，考虑稳定剂是否对花粉活力有影响。其次，考虑稳定剂增加花粉悬浮效果方面的作用。适当浓度的黄原胶、海藻酸钠和羧甲基纤维素钠可作为花粉培养液稳定剂。黄原胶、海藻酸钠以及羧甲基纤维素钠随着浓度的升高而增加花粉悬浮时间，更好地降低花粉浓度的衰减速率，保持花粉培养液的稳定性。经研究发现，高浓度的NaCl 对花粉萌发和花粉管伸长有抑制作用[7]。在本研究中，尽管海藻酸钠和羧甲基纤维素钠在相同浓度条件下的稳定效果好于黄原胶，但由于浓度高于0.3g/L 的海藻酸钠和羧甲基纤维素钠会显著抑制花粉萌发。因此，不宜使用过高浓度的以上2 种稳定剂。而黄原胶随着浓度的上升，既可以保证较高水平的花粉萌发率，又可以进一步增强花粉悬浮效果。本研究通过正交试验得到最优复配稳定剂为黄原胶0.8g/L、羧甲基纤维素钠0.1g/L、海藻酸钠0.1g/L。相关研究表明，在控制溶液稳定效果相同的情况下，使用复配稳定剂可以降低单一稳定剂的添加量，且使体系具有更低的粘度[8]。因此，复配稳定剂的应用可能比单一稳定剂更具有实际生产意义。