基于网络药理学和分子对接探究喜炎平注射液治疗新型冠状病毒肺炎的作用机制

王乐，王京璐，李智英，田梦缘

(邵阳学院 基础医学院，湖南 邵阳，422000)

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)以发热、乏力、干咳为主要症状。目前COVID-19并未找到特效药，主要以隔离治疗和对症治疗为主。根据临床数据表明，中药治疗COVID-19效果较好，患者的治愈率与中药参与率呈正相关[1]，中药在COVID-19防治中有不可替代的作用。

中成药喜炎平注射液作为《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》推荐治疗重型病症中“气营两燔证”使用[2]。喜炎平注射液是由蕨科植物穿心莲中所提取的活性成分穿心莲内酯，通过磺化生成的穿心莲内酯磺酸盐灭菌水溶液，具有良好水溶性[3]，临床上主要用于抗病毒、抗炎抗菌、抗肿瘤、免疫调节等[4]。

网络药理学是融合了多学科的新兴产物，包含了多种数据库检索、计算机模拟、网络分析、数据分析、网络拓扑分析等方法，以组学和大数据为基础，构建网络模型，探索药物与疾病之间的关联，并分析阐明了药物与相关疾病的相互作用关系[5]。本文通过网络药理学技术与分子对接研究喜炎平注射液的物质基础及其治疗COVID-19的可能作用机制，同时也为COVID-19的治疗和喜炎平注射液的深入研究提供思路。

1 材料与方法

1.1 数据库及软件

中药系统药理学分析平台(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)；UniProt数据库(https://www.uniprot.org/downloads)；PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Swiss Target Prediction数据库(http://old. swisstargetprediction. ch/)；SEA数据库(http://sea.bkslab.org/)；GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)；Venny绘图网站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)；STRING数据库(https://string-db.org/)；PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)；Cytoscape3.7.2；OpenBabel-3.1.1软件；软件运行环境：PYMOL&AutoDock tools 1.5.6 & AutoDock Vina 1.1.2操作系统。

1.2 喜炎平注射液主要活性成分筛选及潜在靶点预测

本课题以“穿心莲”为检索词在TCMSP数据库中获取喜炎平注射液的化学成分，以口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18作为筛选条件对在TCMSP中获得的化合物进行筛选，得到喜炎平注射液的活性成分。再利用TCMSP对活性成分进行靶标预测，在UniProt数据库中将靶标蛋白对应Gene Symbol(除去非人源、未经验证和重复的靶点)，将筛选的化合物在Pubchem中检索活性成分14-去氧-12-甲氧基穿心莲内酯(14-deoxy-12-methoxyandrographolide)与14-去氧穿心莲内酯(14-deoxyandrographolide)的SMLILES，并且在Swiss Target Prediction，SEA数据库中进行14-deoxy-12-methoxyandrographolide与14-deoxyandrographolide的潜在靶点预测，综合TCMSP，Swiss Target Prediction和SEA数据库筛选结果，获取穿心莲活性成分对应的潜在作用靶点。14-去氧-11-氧代-穿心莲内酯与穿心莲内酯-19-β-D-葡萄糖甙无SMLILES，无法检索出其潜在靶点预测，故舍去。

1.3 疾病靶点搜集与潜在治疗靶点的获取

以“novel coronavirus pneumonia”作为关键词，检索Gene Cards数据库，去除重复，获得COVID-19相关靶点。

1.4 获取疾病和药物交集靶点

使用Venny绘图网站，将喜炎平注射液潜在作用靶点映射到novel coronavirus pneumonia相关靶点中，制作Venny图。将两者的交集作为喜炎平注射液治疗COVID-19的潜在作用靶点。

1.5 药物-疾病-靶点网络的构建

利用1.4中所获取的治疗靶点与对应的药物通过Cytoscape制作出“药物-疾病-靶点”网络图，使有效活性成分与疾病核心靶点关系达到可视化。

1.6 蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络的构建

将1.4所得到的靶点导入STRING数据库中，种属选择“Homo sapiens”，置信度得分设置为0.4，构建PPI网络，并将文件“string_interactions.tsv”导入Cytoscape进行网络拓扑学分析，通过度(Degree)值大于平均值来筛选核心靶点。

1.7 GO富集分析和KEGG通路分析

利用RStudio的GO_barplot.R和GO_ALL_barplot_count_P.adjust.R脚本对治疗靶点进行GO富集分析；利用RStudio的KEGGenrich.R和KEGG_bubblePlot.R脚本对治疗靶点进行KEGG通路分析。

1.8 分子对接

利用AutoDock tools 1.5.6对喜炎平注射液中对应的活性成分以及关键靶点进行半柔性对接，验证相互作用的活性[6]，并筛选对接打分结果。将活性成分跟与COVID-19相关的SARS-CoV-2 3CL和ACE2进行半柔性对接，验证相互作用的活性，给对接结果进行打分。

具体步骤：(1)从PubChem数据库中下载活性成分的3D结构文件(SDF格式)，用OpenBabel-3.1.1软件将SDF格式转化成mol2格式，并使用AutoDock tools 1.5.6将mol2格式转化为pdbqt格式。(2)从PDB数据库中下载核心靶点的相关结构蛋白(筛选条件设为“Homo sapiens”“X-RAY DIFFRACTION”“Protein”)，利用PYMOL将靶蛋白的pdb格式去水分子，将蛋白质的配体与靶蛋白质分离。利用AutoDock tools 1.5.6将已分离出蛋白质的配体的靶蛋白质与配体的pdb格式转换成pdbqt格式，并确定对接盒子的配体中心与大小。(3)利用vina脚本将活性成分与靶蛋白质进行对接，并通过对接结果进行打分和作图。

2 结果

2.1 喜炎平注射液活性成分和潜在靶点

通过TCMSP检索穿心莲，按条件筛选出的活性成分共24个，其中4个活性成分(表1)与穿心莲内酯有关，其预测靶标数量共17个。在Pubchem中检索活性成分14-deoxy-12-methoxyandrographolide与14-deoxyandrographolide的SMLILES，并且在Swiss Target Prediction，SEA数据库中进行潜在靶点预测，综合TCMSP，Swiss Target Prediction和SEA数据库筛选结果，获取穿心莲活性成分14-deoxy-12-methoxyandrographolide与14-deoxyandrographolide的对应潜在作用靶点140个(已去除重复项)。

表1 穿心莲主要活性成分基本信息

2.2 COVID-19的潜在靶点

通过GeneCards数据库收集到novel coronavirus pneumonia的潜在靶点438个(已去除重复项)。

2.3 疾病和药物交集靶点

使用Venny绘图网站，将喜炎平注射液潜在作用靶点140个映射到novel coronavirus pneumonia相关靶点438个中，制作Venny图(图1)。将两者19个交集靶点作为喜炎平注射液治疗COVID-19的潜在作用靶点。

黑色区域代表预测的药物靶点；灰色区域代表疾病靶点

2.4 药物-疾病-靶点网络

利用1.4中所获取的治疗靶点与对应的药物通过Cytoscape构建网络。制作出药物-疾病-靶点网络图(图2)。

图2 喜炎平注射液治疗COVID-19药物-疾病-靶点网络图

2.5 PPI网络

将19个靶点导入STRING数据库中，将文件“string_interactions.tsv”导入Cytoscape制作PPI网络，见图3(A)，图中19个潜在靶点存在着66条相互作用。利用NetworkAnalyzer进行拓扑学分析，图中节点的灰度深浅程度与Degree值呈正相关，灰度越深Degree值越大，见图3(B)。网络中节点Degree平均值为7.33，介值(betweenness centrality，BC)平均值为0.044 117 647。通过Degree值>7.33(平均值)且介值>0.044 117 647(平均值)来筛选核心靶点，见表2。

(A)共同靶点PPI网络网 (B)核心靶点子网络

表2 喜炎平注射液治疗COVID-19的核心靶点表

2.6 GO和KEGG富集分析

从生物过程(biological process，BP)、细胞组成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)3个功能分别进行GO富集，各组分排名前10名条目见图4。通路涉及细胞对脂多糖的反应(cellular response to lipopolysaccharide)和细胞对细菌起源分子的反应(cellular response to molecule of bacterial origin)，表明喜炎平注射液的靶点主要与抗炎抗菌有关。

图4 潜在靶点的GO富集分析

KEGG富集通路分析，得到136条通路，取排名前20条通路制作气泡图(图5)、成分靶点通路图(图6)。结果显示，喜炎平注射液主要通过调节人类巨细胞病毒感染、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、甲型流感、TNF等信号通路起到治疗COVID-19的作用。

图5 潜在靶点的KEGG富集分析

“V”形节点为信号通路；圆形节点为潜在靶点；三角形节点为穿心莲的有效活性成分

2.7 分子对接

根据2.5的PPI中所分析得到的核心靶点MAPK1，EGFR，MAPK14，JAK1与活性成分14-deoxy-12-methoxyandrographolide，14-deoxyandrographolide进行分子对接，将活性成分14-deoxy-12-methoxyandrographolide，14-deoxyandrographolide与COVID-19相关的基因靶点SARS-CoV-2 3CL和ACE2进行分子对接，见表3。

从表3中数据可知，核心靶点均有较好的结合能，其中，以JAK1的结合效果最佳，具体对接图见图7。分子对接结果表明，喜炎平注射液中的活性成分有较好的抗菌抗炎作用，在COVID-19治疗中起了一定的作用。

表3 分子对接结果

(A)1～6依次为14-deoxy-12-methoxyandrographolide与SARS-CoV-2 3CL，ACE2，MAPK14，EGFR，MAPK1，JAK1对接; (B)1～6依次为14-deoxyandrographolide与SARS-CoV-2 3CL，ACE2，MAPK14，EGFR，MAPK1，JAK1对接

3 讨论

COVID-19以发热、乏力、干咳为主要症状，重症患者多在发病1周后出现呼吸困难和/或低氧血症，或快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍及多器官功能衰竭。喜炎平注射液是一种穿心莲制剂，穿心莲味苦，性寒，具有解热、降温、免疫调节、抗炎、抗肿瘤等作用，主要对症治疗COVID-19的重症症状。

在本研究中，通过对网络药理学和分子对接研究喜炎平注射液治疗COVID-19的机制，发现COVID-19重型病症中“气营两燔证”可通过注射中成药喜炎平注射液进行对症治疗，更加确定了中药在治疗COVID-19中的可行性。

通过对喜炎平注射液治疗COVID-19的网络药理学可知，该药的核心活性成分为14-deoxy-12-methoxyandrographolide和14-deoxyandrographolide，并对这两种活性成分进行靶点预测，获得对应靶点140个，通过与novel coronavirus pneumonia疾病靶点(438个)进行交集，获得19个喜炎平注射液治疗COVID-19的靶点。对这19个交集靶点进行PPI网络构建，可得到与炎症相关的核心靶点如MAPK1，EGFR，MAPK14，JAK1。当SARS-CoV-2感染人体后，尽管快速的免疫反应会成为抵抗病毒感染的第一道防线，但过度的炎性反应和受损的宿主免疫防御能力可能会导致组织损伤。尤其是大量的细胞因子和趋化因子释放，即“细胞因子风暴”，清楚地反映了宿主免疫防御的广泛失控失调[7]，引起急性呼吸窘迫综合征与多脏器衰竭，甚至引发患者死亡。核心靶点丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)作为信号从细胞表面转导到细胞核内部转导途径的重要组成部分，是广泛调控炎症反应的重要信号转导通路之一[8]，研究显示，MAPK成员可通过下调炎症因子水平来发挥其抗炎活性[9-10]。在临床上，与JAK1基因的表达密切相关的乌头生物碱类药物用于治疗类风湿关节炎症[11]。另外，有研究表明，左金方通过下调JAK1相关蛋白的表达来发挥抗菌作用，减少炎性介质的产生，进而逆转脓毒症引起的肺损伤[12]。由此可推测，本研究的核心靶点与炎症密切相关，对喜炎平注射液治疗COVID-19有一定的指导意义。

通过对交集靶点进行GO富集，对BP条目的分析可知，通路涉及细胞对脂多糖的反应和细胞对细菌起源分子的反应，表示喜炎平注射液的靶点可能与抗炎抗菌有关。通过对交集靶点进行KEGG富集分析，前20条中有4条通路与病毒、流感、炎症有关，如人类巨细胞病毒感染、SARS-CoV-2、甲型流感、TNF信号通路，提示喜炎平注射液可能与抗炎、抗病毒有关，在炎症反应和免疫调节中发挥重要作用，可减轻SARS-CoV-2引起炎性因子释放和异常增多，减少肝、肺、肾等组织的损伤[13]。其中巨噬细胞与炎症相关反应的调节有着密不可分的联系，有研究表明，喜炎平注射液通过调节巨噬细胞抑制细胞分泌TNF等炎性因子从而发挥抗炎作用[14]。在临床研究中，脓毒症重症患者外周血中的TNF-α水平均高于其他患者，由此可见，人体中TNF含量与脓毒症有较大联系[15]，喜炎平注射液可通过抑制TNF信号通路来抑制和治疗COVID-19引起的炎症反应和脓毒症。所以，喜炎平注射液可能通过抑制COVID-19患者体内的炎症因子风暴、过度的免疫反应等从而发挥治疗COVID-19的功效。

研究发现，SARS-CoV-2与病毒SARS-CoV有着高达79.5%的同源性，二者受体均为ACE2[16]。ACE2作为SARS-CoV-2细胞内受体是SARS-CoV-2感染并入侵机体的关键基因[17]。本研究采用网络药理学结合分子对接的方法，从蛋白质相互作用网络中筛选Degree值、介值均高于平均值的靶点与中药穿心莲中的活性成分对接。研究表明，配体与受体结合时所需的结合能越低，发生作用的可能性越大，结合构象越稳定[18]。结合能>-5.0 kcal/moL，说明分子与靶点有较好的结合活性，亲和力高；结合能>-0.7 kcal/moL，则说明分子与靶点的结合构型具有强烈的结合活性[19]，亲和力强。结果显示，14-deoxy-12-methoxyandrographolide和14-deoxyandrographolide与SARS-CoV-2 3CL,ACE2核心靶点的结合能均<-5.0 kcal/moL，具有较好的结合活性，与炎症相关基因JAK1的结合能较其他基因更牢固，故推测活性成分对炎症有较好疗效。

综上所述，喜炎平注射液可能通过抗病毒、抗炎等相关通路来治疗COVID-19。本研究初步确定了喜炎平注射液治疗COVID-19的活性成分及其核心靶点的组成，为临床合理应用提供了一定的理论依据。