根瘤农杆菌T-DNA插入介导的烟曲霉耐药突变菌的分子机制

龙南彪

(邵阳学院 医学技术学院，湖南 邵阳， 422000)

烟曲霉是一种分布广泛的条件致病真菌，在免疫缺陷的个体中，由烟曲霉导致的肺部感染具有较高的病死率[1]。近年来，虽然医疗技术发展迅猛，但免疫缺陷的人数却逐年增多，烟曲霉发病率也呈上升之势[2]。与细菌不同，烟曲霉致病机制主要与其占位生长相关。影响烟曲霉生长的因素诸多[3]，主要有：(1)食物获取。包括碳源、氮源、无机盐(铁、钙、锌、铜以及磷酸盐等)。(2)宿主环境。如低氧、pH变化、氧化应激、热刺激等。(3)细胞壁结构。如黑色素(melanin)、葡聚糖、疏水蛋白、GAG(galactosaminogalactan)等。(4)其他因素。如生物膜及混合感染等。

目前，治疗曲霉病的药物主要有两类。一类是唑类药物，其机制是阻断细胞膜的主要成分——麦角固醇的生物合成；另一类是阻断β-1,3 glucan合成[4]。有数据显示，临床分离的烟曲霉菌株中3.2%具有单重或多重耐药[3]。烟曲霉对唑类药物耐受的机制主要与其药物靶点Cyp51A位点突变以及启动子区插入突变有关[5-6]。相关研究显示，烟曲霉对唑类药物的耐药性可能与线粒体功能紊乱以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生密切相关[7]。

通过用根瘤农杆菌T-DNA介导的插入突变构建了一个含1 805株烟曲霉的突变体库,并从中筛选到16株唑类药物耐药突变株[8]。本研究挑取了第7号突变株(M7)进行了T-DNA插入位点鉴定、相关基因敲除以及耐药表型试验。研究发现，M7耐药表型并不是因为其插入位点相关基因Afu5g08910突变引起，而是由Cyp51A在第54位Gly错义突变所致。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌株：烟曲霉菌株Δcyp51A由南京师范大学张弛博士馈赠；ΔM7以及Δcyp51AGly54Arg为本研究构建；DH5α感受态细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

主要试剂：高保真酶Phanta Max Super-Fidelity和重组克隆试剂盒One Step Cloning Kit C115购自Vazyme公司；普通Easy-taq DNA聚合酶和连接载体pBluntzero购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、引物DNA以及潮霉素(hygromycin B)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；SpeI内切酶购自Taraka公司。

1.2 烟曲霉的培养及耐药性分析

烟曲霉的培养使用YAG/YUU培养基，具体配置方法参照文献[9]。为检测烟曲霉的耐药性，在YAG培养基中添加了不同浓度的伊曲康唑(ITZ)。烟曲霉培养温度为37 ℃，培养时间为2～3 d。

1.3 烟曲霉农杆菌插入突变株基因组重测序

首先，用YAG液体培养基培养待测烟曲霉菌株20 h，然后,用无菌纱布将培养基滤干，立刻置于液氮中速冻。所有菌株的DNA提取、建库、测序及分析均由上海欧易生物医学科技有限公司完成。流程如下：提取烟曲霉基因组DNA进行电泳检测，合格后再随机打断成350～500 bp的片段，经过片段末端修复、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成建库，然后，经Illumina测序后进一步进行T-DNA插入位点分析及SNP位点鉴定。

1.4 烟曲霉基因敲除与回补

主要利用同源重组法进行基因敲除[10]。首先,用引物M7 P1/P3和M7 P4/P6分别扩增M7基因(Afu5g08910)左右同源臂，pyr4 F/R扩增筛选Marker pyr4。然后,用引物M7 P2/P5，以左右同源臂和筛选Marker pyr4做模板，经融合PCR扩增即可将3个片段融为一体作为敲除载体。再将其与克隆载体pBlunt zero连接，导入感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆即可。对于Cyp51A位点突变载体的构建，首先,用Cyp51A F/R将Cyp51A基因(包括启动子区、ORF及UTR区)扩增。然后,将其重组到p-zero-hph载体(筛选Marker是潮霉素)的Spe I位点。对于M7基因敲除，使用的背景菌株为A1160，Cyp51A位点突变回补则在Cyp51A背景上进行。敲除突变菌用诊断引物M7 S1/S2进行验证，确保目的基因完全被敲除。对于使用潮霉素作为筛选Marker的菌株，培养基中需添加200 μg/mL的潮霉素。使用的所有引物见表1。

表1 引物列表

1.5 烟曲霉基因组提取

用无菌牙签刮取少量菌丝体至500 μL Lysis buffer中，60 ℃加热30 min，然后加入150 μL醋酸钾溶液震荡30 s，12 000 g离心10 min，吸取上清液至无菌的1.5 mL的离心管中，加入等体积异丙醇涡旋混匀，12 000 g离心3 min，去上清，加400 μL 70%乙醇洗涤沉淀，12 000 g 离心1 min，去上清，干燥DNA后加适量去离子水溶解DNA。提取的DNA可以直接用于诊断PCR或者DNA片段回收扩增。

2 结果

2.1 农杆菌T-DNA介导的插入突变菌鉴定

从图1(A)可以看出，相较背景菌株Af293而言，M7展示出很明显的耐药性。为深入研究M7耐药性产生的机制，对其基因组进行了重测序。测序结果发现，根瘤农杆菌T-DNA插入的位置位于Afu5g08910基因内部见图1(B)。为验证基因组重测序是否准确，在Afu5g08910基因两侧设计了一对诊断引物，通过诊断PCR发现，Af293中Afu5g08910基因以及内参基因扩增大小均正确，而M7只有内参基因扩增出了条带，说明Afu5g08910基因中插入了一个较大的DNA片段见图1(C)。综上所述，通过基因组重测序,本研究成功鉴定了M7中农杆菌T-DNA插入位置位于Afu5g08910基因中。

(A) 烟曲霉突变株M7耐药表型分析;(B) M7突变株中T-DNA插入位点分析；(C)M7突变株中T-DNA插入位点验证

2.2 敲除菌耐药性分析

对烟曲霉A1160进行敲除，命名为ΔM7。如图2(A)所示，诊断PCR显示ΔM7中左右同源臂均发生了同源重组。野生型菌株(WT)中Afu5g08910有明显的扩增条带，且大小正确，而ΔM7中未见有扩增条带，说明Afu5g08910被完全敲除了。进一步，在含有伊曲康唑的平板上对ΔM7的耐药性进行了测试，结果发现,ΔM7和WT的耐药性程度无明显差别，见图2(B)，说明农杆菌T-DNA插入突变株M7耐药性产生的机制可能与Afu5g08910的突变无关。

图2 ΔM7敲除菌验证(A)和耐药性分析(B)

2.3 农杆菌T-DNA插入突变株SNP分析

上述基因组重测序以及诊断PCR均证明农杆菌T-DNA插入位点位于Afu5g08910内，但其敲除却未表现出耐药性。SNP位点分析发现，M7中cyp51A第160位碱基由G突变成了C，见图3(A)，导致Cyp51A第54位氨基酸由Gly突变成了Arg，见图3(B)。Cyp51A是唑类药物的作用靶点，其突变可以导致其与唑类药物的结合能力下降，从而导致耐药性。图3(C)显示，当敲除cyp51A时，相较于WT，Δcyp51A对唑类药物ITZ的敏感性显著提高，而在Δcyp51A中转入Gly54Arg突变的Cyp51A时，Δcyp51AGly54Arg相比于WT而言对ITZ的耐药性明显增强，说明Cyp51A的Gly54Arg突变可导致烟曲霉耐药性产生。因此，M7之所以表现出唑类药物耐受，可能与Cyp51A的Gly54Arg的突变有关。

(A)和(B) M7中cyp51A的SNP位点鉴定以及模式图;(C) Δcyp51A突变回补菌耐药性分析

3 讨论

目前临床上治疗侵袭性曲霉病的一线药物是唑类药物[11]，其主要通过结合麦角固醇合成的关键酶Cyp51A抑制曲霉活性从而达到抑制其生长的目的[12]。然而，Cyp51A的突变严重削弱了唑类药物的治疗效果[13]。Cyp51A突变频率较高的位点主要集中在ORF区的G54,G138,M220和G448以及启动子区串联序列的插入(TR34/L98H,51TR46/Y121F/T289A和TR53)[5]。目前认为，导致真菌耐药性产生的原因主要有2个：(1)农业上广谱抗真菌农药的应用，使土壤中对药物敏感的菌株被杀灭，而存留下来的均具有一定的耐药性，这些耐药性菌株可进一步感染人体；(2)临床上抗真菌药物的应用使敏感菌株被杀灭，而具有耐药突变的菌株则可继续存活，导致治疗效果不佳[14]。

本研究中，发现农杆菌T-DNA插入突变株M7(Afu5g08910)耐药性的产生并不是因为Afu5g08910插入突变产生，而是由于M7中Cyp51A第54位Gly突变所致。本研究前期构建的烟曲霉突变体库只有1 805株而耐药性菌株却达到了16株，这16株耐药突变菌一部分并不是T-DNA插入导致相关基因失活所致，而是某些位点突变所致。本研究后续对其中8株基因组重测序分析发现，有2株(包括M7)在Cyp51A编码区发生了突变，其他菌株在其他位点也存在部分位点突变，但尚未进一步验证。对于这些T-DNA插入突变株中位点突变产生的机制，可能与烟曲霉自身基因突变有关，实验过程用唑类药物进行筛选实际上起到了一个选择的目的。事实上，除了唑类药物压力外，若施加其他的压力也会起到类似的筛选作用，如以前实验室通过农杆菌T-DNA插入突变库筛选低铁敏感突变株，T-DNA插入位点经tail-PCR以及基因组重测序双重验证后发现目的基因的敲除并没有表现出低铁敏感的现象，现在之所以出现这种情况，可能是某个对低铁敏感的基因位点突变所致，当然，这需要进一步研究证实。

综上所述，本研究为以后突变体库筛选过程中遇到的插入突变基因与目的表型不一致的现象提供了参考。