健康人血清四环素、磺胺类抗生素水平及内暴露概率评估

贺栋梁，李静娜，龙彩虹，吴成秋

(1.衡阳市中心医院，湖南 衡阳，421001；2.南华大学公共卫生学院，湖南 衡阳，421001；3.武汉市疾病预防控制中心，湖北 武汉，430015；4.衡阳市疾病预防控制中心，湖南 衡阳，421001)

自四环素、磺胺类等广谱抗生素被用于医学、畜牧业及农业以来，土壤、动物粪便和牛奶产品等被相继报道有抗生素残留[1-2]，已开展系列研究构建，高效液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)同步检测方法，监测动物性食品四环素[3]、磺胺类[4]等抗生素污染状况。前期研究虽然提供了抗生素同步检测方法和基础数据集，但该数据集仅能反映人群抗生素外暴露的可能，而内暴露水平则可综合反映外来化学物浓度、生物富集系数、人体吸收、代谢及排泄等多因素、全过程作用的结局，因此更具有实际意义。据此，本文检测33例健康人血清四环素及磺胺类抗生素含量，对检出率高的抗生素行Monte Carlo概率模拟，以评估人群内暴露水平。

1 资料与方法

1.1 样本来源

2020年11月至12月，预约预防性健康检查，拟从事食品、饮用水、化妆品生产及公共场所直接为顾客服务的人员，经筛选后共获得血清样本33份。其中男性9例，年龄(29.33±8.69)岁；女性24例，年龄(35.75±11.54)岁。男、女性别间年龄比较差异无统计学意义(t=1.51，P=0.141)。纳入标准：(1)知情同意；(2)近3个月内未使用过抗生素；(3)体检结果符合从业人员健康要求。排除标准：(1)肝肾功能障碍；(2)既往精神疾病史。

1.2 样本预处理

取血液样本3 mL，加入乙腈2 mL后，转入50 mL离心管中，加入0.1 mol/L的EDTA-Mcllvaine缓冲液10 mL后，顺序进行1 000 r/min涡旋1 min、超声提取10 min、10 000 r/min离心10 min，收集首次提取液后并重复一次缓冲、涡旋、超声、离心等过程，2次提取液合并。

1.3 固相萃取柱的活化及LC-MS/MS检测

HLB固相萃取小柱依次用甲醇和超纯水各6 mL活化，上样后用5%甲醇水溶液3 mL淋洗，甲醇6 mL洗脱目标物并收集洗脱液，经弱氮气流吹干后以蒸馏水定容至1 mL，经0.22 μm滤膜过滤后上机行LC-MS /MS检测。色谱条件、质谱条件参照LC-MS/MS同步检测四环素类、磺胺类抗生素方法[3-4]设置。质量控制措施包括同步测定全过程空白、测定空白和基质加标回收率等，每测定10个血清标本时，测定标准参照物(购自美国 Sigma 公司)并将结果加入标准曲线校正斜率。

1.4 Monte Carlo概率模拟

基于33例血清样本抗生素含量的检测数据，运用Oracle Crystal ball软件模拟高检出率抗生素的最优分布，以最优模拟分布的参数为指标，转入软件迭代计算5 000次以模拟计算机抽样，产生大样本数据后计算不同抗生素内暴露水平下的人群累积概率风险。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 色谱图、标准曲线、加标回收率及相对标准偏差

在选定色谱条件下，混合标准系列中的抗生素可完全分离，色谱峰型尖峭，无杂峰。拟合抗生素组分的标准曲线分别为金霉素(CTC)：y=111.719x-54.776，r2=0.998；土霉素(OTC)：y=66.575x-5.438；r2=0.997；多西环素(DOX)：y=585.022x-1157.01，r2=0.997；四环素(TC)：y=137.761x+157.319，r2=0.999；磺胺甲噻二唑(STZ)：y=22.002x-19.730，r2=0.997；磺胺二甲基嘧啶(SM2)：y=361.07x-21.503，r2=0.999；磺胺吡啶(SPD)：y=236.139x+303.357，r2=0.998；磺胺甲恶唑(SMZ)：y=203.771x-48.486，r2=0.999；磺胺氯哒嗪(SCP)：y=245.941x-218.249，r2=0.998；磺胺甲基嘧啶(SM)：y=177.167x-34.310，r2=0.999；磺胺异恶唑(SIA)：y=175.803x+13.239，r2=0.999。不同组分的加标回收率介于85.62%～113.84% ，RSD为0.6%～7.5%。

2.2 抗生素检出率及检出水平

表1和表2显示，受检的11种目标抗生素中，4种四环素及2种磺胺类抗生素有检出，呈偏态分布，检出率高低顺位依次为金霉素(CTC)>磺胺甲噻二唑(STZ)>磺胺甲恶唑(SMZ)>四环素(TC)>多西环素(DOX)>土霉素(OTC)，检出阳性的抗生素性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。此外，磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺甲基嘧啶(SM)、磺胺异恶唑(SIA)等5种磺胺类抗生素未检出。

表1 血清抗生素检测阳性例数

表2 血清CTC,STZ,SMZ,TC,DOX,OTC等抗生素含量

2.3 不同抗生素含量Spearman关联与检出率Kappa系数

对检测阳性抗生素组分行Spearman 相关性分析，未见抗生素间存在等级相关性(P>0.05)，见表3。此外，Kappa系数计算结果表明，不同抗生素在同一血清中的检出结果并无一致性(P>0.05),见表4。

表3 不同抗生素含量的Spearman相关性

表4 不同抗生素检出的一致性

2.4 内暴露水平的Monte Carlo模拟

对检出率高、符合概率模拟条件的抗生素进行概率模拟，结果表明,其内暴露水平服从Logistic,Min Extreme,Beta等不同分布类型，见表5。累积概率图示50%及95%个体的5种抗生素内暴露水平分别为CTC(1.71和4.22 g/mL)，DOX(0.21和1.25 g/mL)，TC(1.64和3.51 g/mL)，STZ(0.88和1.76 g/mL)，SMZ(0.50和1.00 g/mL)等，见图1。

表5 血清5种抗生素含量的最佳拟合分布类型及P50,P95水平

图1 5种抗生素不同内暴露水平下的累积概率

3 讨论

抗生素因被滥用而演变成全球公共卫生问题[5]。现有的限制抗生素滥用政策主要是针对临床和医源性，如要求临床应用实行抗菌药物分级管理[6]、三级医院停止儿科以外门诊患者输注抗菌药物等，而滥用导致非医源性暴露的潜在危害极少关注。本次检测不同年龄、不同性别、未经临床用药的健康人血清， CTC,STZ,SMZ,TC,DOX,OTC等抗生素被检出，提示抗生素可经非医源性暴露途径如环境因素、食物链等无差别转移进入人体，导致潜在的健康风险。因此，在规范抗生素临床应用的同时，控制环境介质污染所致的非医源性暴露同具重要意义。

Monte Carlo概率评估方法用于风险与暴露评估的合理性得到国际公认，它能有效解释暴露时个体吸收、代谢能力变异性及接触途径、剂量不确定性[7]。本次运算逻辑是利用专业软件Crystal Ball的内置程序步，模拟检测阳性抗生素在血清中的分布类型，有效描述了该分布的参数转入后续计算程序步迭代计算。计算全过程采用随机抽样的方法，计算机模拟抽样则由迭代计算实现，更好地模拟了人群中不同个体在外暴露程度、机体代谢与排泄能力不同时的随意性和不确定性。此外，随着计算迭代次数的不断增加，也间接起到了样本放大的作用，进而使估计值更趋于稳定。

过度使用抗生素破坏肠道微生态[8]、诱发耐药性[9]及增加过敏风险[10]等暴露风险多有报道，本研究中同一血清样本检出多种抗生素的事实说明，针对单一抗生素健康风险的探索忽略了多组分共存时的联合效应，可能并不契合人们多途径、多组分同时暴露的客观规律。本监测得到的单一抗生素含量数据，若可基于某种“危害等效系数”换算，可更好地反映抗生素内暴露的整体水平，对其潜在危害的风险评估、预判和控制工作具有更重要的意义。据此认为，契合人群多途径、多组分共暴露抗生素的特点，不同抗生素健康危害的等效性研究有望成为新的研究热点。