高效液相色谱法测定复方尿囊素乳膏中尿囊素的含量

丁志军，李小兰，付志媛

江西省皮肤病专科医院，江西 南昌 330001

复方尿囊素乳膏是江西省皮肤病专科医院外用乳膏制剂，主要由尿囊素、维生素E、二甲硅油、羟苯乙酯及基质组成。临床上主要用于皮肤干燥皲裂、皮肤瘙痒、鳞屑性皮肤病，疗效显著。尿囊素能增加皮肤角质层细胞粒合质的吸湿能力，并直接作用于角质蛋白分子，促进其吸收水分，使皮肤光滑柔软。制剂原标准对尿囊素含量测定采用紫外分光光度法［1-2］，专属性不强，其测定操作过程复杂、过滤困难，影响测定重复性。为了更好的控制制剂质量，保证制剂疗效，采用高效液相色谱法（HPLC）测定复方尿囊素乳膏中尿囊素的含量。

1 材料

1.1 仪器

Agilent1260 高效液相色谱仪（美国），BT-125D Sartorius型电子天平；岛津UV-1800型紫外分光光度计。

1.2 试药

尿囊素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111501-200202）；磷酸二氢钠（广东光华科技股份有限公司，批号：20190829）；磷酸氢二钠（广东光华科技股份有限公司，批号：20190829）；复方尿囊素乳膏（江西省皮肤病专科医院，批号：210301、210302、210303），蒸馏水（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠0.87 g、磷酸氢二钠1.35 g，加水使溶解成1 000 mL）；检测波长为210 nm；流速为0.4 mL/min；柱温：20 ℃。理论塔板数按尿囊素峰计应不低于8 000。主成分峰与相邻杂质峰的分离度应大于1.5。

2.2 对照品溶液的制备

取尿囊素对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL 含13.2 μg 的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取样品约0.45 g，精密称定，置100 mL 量瓶中，加水适量，置于65 ℃水浴中加热约10 min，振摇使尿囊素溶解，放凉至室温后，用水稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却2 h 以上，取出，迅速过滤，滤液放至室温，备用。

2.4 阴性对照溶液的制备

称取按复方尿囊素乳膏处方工艺方法制备的不含尿囊素的阴性样品适量，按“2.3”项下方法制备。

2.5 专属性试验

按上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。结果，供试品在与对照品色谱图相应的位置上有相同的尿囊素峰，而阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图：A.溶剂；B.阴性对照溶液；C.对照品溶液；D.样品溶液

2.6 线性关系考察

精密称取尿囊素对照品16.07 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL，置25 mL 量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀，分别取10 μL 注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，进行线性回归，尿囊素的回归方程为：Y=2 503.415 6X+4.802 4（r=0.999 95），线性范围为0.064 28～0.642 80 μg。

2.7 检出限

取尿囊素对照品适量，用水溶解并逐级稀释后测定，尿囊素的检出限为0.117 ng。

2.8 精密度试验

取对照品溶液，注入液相色谱仪，连续进样6次，每次10 μL，测得尿囊素平均峰面积值，RSD为0.18%，表明仪器精密度良好。

2.9 稳定性试验

精密吸取对照品溶液，室温条件下连续进样3 d，测得尿囊素平均峰面积值，结果显示尿囊素有降解现象，配制后8 h 内RSD 为0.68%（n=5），24 h 内RSD 为2.27%，48 h 内RSD 为4.33%，72 h 内RSD为15.44%，建议对照品溶液在配制后8 h 内使用。

将新配制的对照品溶液用环己烷液封于冰箱（5 ℃）中放置保存，室温条件下连续15 d 测定，测得其RSD 为1.13%，结果显示，尿囊素对照品水溶液在5 ℃至少可稳定15 d。

2.10 重复性试验

取同一批样品6 份，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，进样量为10 μL，测得峰面积值，计算尿囊素含量，RSD 分别为0.19%，表明此法重复性良好。

2.11 加样回收率试验

取同一批已知含量的样品（批号210301）7 份，分别精密加入尿囊素对照品溶液（精密称取尿囊素对照品16.39 mg，置25 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得）1 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，进样量为10 μL。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=7）

2.12 样品含量测定

取本品3批，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，进样量为10 μL，按外标法计算复方尿囊素乳膏中尿囊素标示量的百分含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 检测波长的确定

参考文献［3-4］，尿囊素的检测波长有210、217、224 nm，同时考虑到磷酸盐缓冲液的截止波长为200 nm，结合尿囊素对照品水溶液紫外分光光度计在190～400 nm 波长范围内扫描结果，最终选择210 nm 为尿囊素的测定波长。

3.2 流动相的选择

参考文献［5-15］的方法，选择甲醇-水（5 ∶95）、甲醇-0.1%磷酸溶液（5 ∶95）、0.01 mol/L 磷酸二氢钾溶液、水等作为流动相。经摸索，结果以磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠0.87 g、磷酸氢二钠1.35 g，加水使溶解成1 000 mL）为流动相跑出的基线平坦、峰形对称，分离效果最好，故选其作为流动相。

3.3 色谱柱的选择

本试验曾采用普通C18 柱进行测定，结果尿囊素在几分钟内就出峰，与溶剂峰分不开，为进一步延长尿囊素的出峰时间，需降低流动相中有机相甲醇的比例，采用纯水为流动相的SB Aq 色谱柱，能使尿囊素峰分离且基线稳定。也曾考察过氨基柱，但跑出的色谱图基线不平，影响尿囊素峰积分的准确性，同时氨基柱的使用寿命短。因此，采用Agilent ZORBAX SB-Aq 为本试验的色谱柱。

3.4 溶媒的选择

尿囊素在热水、氯化钠试液中溶解，在乙醇中不溶，因此，先后选择用纯化水以及流动相为提取溶剂进行了考察，结果采用纯化水、流动相作为样品处理的提取溶剂均能将尿囊素提取完全。考虑到盐对色谱柱的影响，最终选择水为提取溶剂。另外，对提取温度、提取时间进行了单因素试验考察，结果水浴温度为65 ℃、提取时间10 min 时含量最高，故选择65 ℃水浴加热提取10 min。

综上所述，利用HPLC 法检测复方尿囊素乳膏中尿囊素含量快速、简便、准确、灵敏度高，该方法能有效控制复方尿囊素乳膏的含量。