人MAPK3基因原核表达载体的构建及鉴定*

石松， 薛殿婷， 张培， 石静**， 孙达权**

(1.黔东南苗族侗族自治州人民医院 重症医学科， 贵州 凯里 556000； 2.贵州医科大学 基础医学院 生化与分子生物学教研室， 贵州 贵阳 550025)

人丝裂原激活蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)又叫细胞外信号调节激酶1(extracellular signal-regulatedkinase 1，ERK1)，是由第16号染色体p11.2处的MAPK3基因编码，是大鼠肉瘤原癌蛋白(rat sarcoma proto-oncoprotein，Ras)-快速加速纤维肉瘤激酶(rapidly accelerated fibrosarcoma kinase，Raf)-丝裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)-丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路的关键成员之一[1-3]。有研究表明，丝裂原活化蛋白激酶1/3(mitogen-activated protein kinase 1/3，MAPK1/3)与细胞的生长增殖、自噬存活及迁移等功能密切相关[4-8]；同时，MAPK1/3也参与多种病理进程，许多原癌基因编码的蛋白可通过ERK/MAPK信号通路实现相应的细胞学效应，而ERK/MAPK信号通路的持续激活可以加速诱发肿瘤发生、发展和恶化[9-13]。目前，虽然有许多文献描述了MAPK1/3在肝癌等多种肿瘤中的作用，但单独研究MAPK3对肝癌作用的文献不多。本研究克隆了人MAPK3基因的蛋白编码区、构建原核表达载体、用IPTG诱导MAPK3在细菌中表达，并用Sepharose 4B纯化MAPK3蛋白，为后续研究MAPK3的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞和血清来源 正常人肝细胞系HL-7702细胞购自中科院上海细胞库，新生牛血清购自杭州四季青。

1.1.2主要试剂和仪器 固体粉末细胞培养基RPMI-1640(美国Gibco)，TRIzol(美国Invitrogen)，mRNA反转录试剂盒、高保真Taq DNA polymerase、3′末端加脱氧核糖腺苷酸(deoxyriboadenosine，A)试剂盒、脱氧核糖胸苷酸-脱氧核糖腺苷酸(deoxythymidylate-deoxyriboadenosine，T-A)克隆试剂盒、大肠杆菌RY13株的第一种限制性内切酶(escherichia coli RY13Ⅰ，EcoR Ⅰ)、黄单胞菌的第一种限制性内切酶(Xanthomonas holcicola Ⅰ，XhoⅠ)、T4 DNA ligase及DNA纯化回收试剂盒(大连宝生物)，谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase，GST)标签抗体(南京巴傲得生物)，Glutathione Sepharose 4B树脂(美国Pharmacia)，质粒小量抽提试剂盒和感受态细菌(北京天根生物)，pGEX-4t-1保存于本实验室，引物合成和DNA测序委托上海生工完成。聚合酶链式反应仪(polymerase chain reaction machine，PCR仪)(美国伯乐)，DYCP-32B琼脂糖凝胶水平电泳仪、DYCZ-24DH蛋白垂直电泳仪及DYCZ-40G转印电泳仪(北京六一)。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 人肝细胞HL-7702置于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2总RNA抽提与反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR) 细胞在直径6 cm的培养皿中培养融合至70%时，弃培养液，灭菌的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)清洗贴壁细胞3次，取TRIzol 1mL按说明书抽提细胞内总RNA，对抽提的RNA进行浓度定量和琼脂糖凝胶电泳检测。取总RNA 4 μg，按反转录试剂盒说明书配制反应体系，42 ℃反应60 min，将mRNA反转录成cDNA。按NCBI GenBank中人MAPK3基因序列(NM_002746)设计引物，上游引物为5′-TGAATTCATGGCGGCGGCGGCGGCTCAGGGGG-3′，下游引物为5′-TCTCGAGCTAGGGGGCCTCCAGCACTCCGGGC-3′。为方便构建目的DNA质粒，本研究在上游引物的5′末端插入EcoR Ⅰ酶切位点，在下游引物的5′末端插入XhoⅠ酶切位点。以cDNA为模板，按说明书加入上和下游引物、dNTPs及高保真DNA聚合酶，按94 ℃预变性3 min，94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1.5 min，循环31次；72 ℃、10 min的反应条件扩增人MAPK3基因中的蛋白编码区DNA片段。

1.2.3T-A克隆与DNA测序鉴定 取1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，胶回收试剂盒回收目的DNA片段。回收的DNA片段用加“A”试剂盒根据说明书配制反应液，65 ℃加“A”，产物与TA克隆载体pMD18-T于16 ℃连接120 min。连接产物用热激法导入感受态细菌DH5α，氨苄青霉素琼脂糖平板培养基筛选培养。当单克隆菌落形成后，挑取菌落进行扩大培养，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，获得的质粒用EcoR Ⅰ/XhoⅠ进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，条带大小与预期一致的质粒进行DNA送样测序，测序结果正确的质粒命名为pMD18-T-MAPK3GST。

1.2.4重组原核表达质粒pGEX-MAPK3GST的构建 用EcoR Ⅰ/XhoⅠ对pMD18T-MAPK3GST和原核表达载体pGEX-4t-1分别进行双酶切，从前者质粒中获取MAPK3GST目的DNA片段，从后者中获取骨架载体，回收的DNA片段用T4 DNA ligase于16 ℃连接120 min；连接产物用热激法导入感受态细菌DH5α中；含有氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)固体培养板筛选培养，挑取单克隆菌落扩大培养，抽提质粒和双酶切鉴定，通过DNA测序进行再次验证，所需重组质粒命名为pGEX-MAPK3GST。

1.2.5原核诱导表达GST-MAPK3融合蛋白 纯化的原核表达质粒pGEX-MAPK3GST转化感受态Rosetta细菌，含氨苄青霉素的LB固体培养基筛选培养，挑取菌落并扩大培养；取菌液1 mL置于200 mL LB 培养基中，200 r/min于37 ℃摇菌至450 nm波长的光密度(λ=450 nm optical density，OD450 nm)为0.4，摇床温度调至21 ℃，加10 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)诱导GST-MAPK3融合蛋白表达2 h。

1.2.6十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)与考马斯亮蓝染色 取诱导前/后的菌体和蛋白等样品进行制样。菌体中加入含有1%Triton X-100的PBS 1 mL，并加入终浓度1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride， PMSF)；用匀浆器反复匀浆，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液和沉淀加入SDS上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min，瞬时离心。蛋白样品直接加入SDS上样缓冲液制样，样品进行SDS-PAGE，当电泳结束后剥离变性胶、固定液固定后用0.25%(W/V)的考马斯亮蓝R-250室温染色2 h、用脱色液脱去背景色。

1.2.7蛋白免疫印迹 样品经SDS-PAGE后，用1×转膜缓冲液(CAPS/L 2.2 g，10%甲醇，NaOH调节pH值至10.5)对变性胶室温平衡30 min，冰浴中用500 mA转印45 min；转印结束后剥离聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，利用三羟甲基氨基甲烷溶液配制的氯化钠和吐温20溶液(tris-buffered saline and tween 20，TBST)配制的5%BSA于37 ℃封闭30 min；TBST清洗3次，10 min/次；TBST稀释的一抗4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次，10 min/次；用TBST稀释的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗于室温孵育2 h，TBST清洗3次、10 min/次；电化学发光液(electrochemiluminescence，ECL)进行显色反应。

1.2.8蛋白纯化和鉴定 1 mmol/L IPTG于20 ℃诱导4 h，4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min，收集菌体；加含1mmol/L PMSF的PBS后，冰浴超声破碎(超声功率为300 W，5 s/次、间隔5 s、超声50次)；菌体破碎，液体转入50 mL离心管中，4 ℃ 下7 500 r/min离心15 min，分别取上清和沉淀；分别用变性胶上样缓冲液制样进行SDS-PAGE，电泳结束后进行考马斯亮蓝R-250染色和蛋白免疫印迹实验；确定目的蛋白在上清蛋白液中后，将上清蛋白液与Glutathione Sepharose 4B琼脂糖凝胶于4 ℃杂交60 min、1 000 r/min离心15 s、收集琼脂糖凝胶，PBS清洗3次、10 min/次，10 mmol/L谷胱甘肽洗脱液于室温摇床上孵育30 min，4 ℃下1 000 r/min离心15 s，收集洗脱液，制备样品进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝R-250染色和蛋白免疫印迹验证。

2 结果

2.1 人MAPK3基因编码区克隆及其原核表达质粒pGEX-MAPK3GST构建

首先通过RT-PCR获得人靶基因MAPK3的蛋白编码区DNA片段，其长度为1.2 kb，利用T-A克隆将目的基因插入pMD18-T中，构建了含有靶基因的pMD18-T-MAPK3GST；DNA测序结果证明pMD18-T-MAPK3GST正是所需质粒，MAPK3基因蛋白编码区无任何点突变；用限制性核酸内切酶双酶切原核表达质粒pGEX-4t-1和pMD18-T-MAPK3GST，重组后获得pGEX-MAPK3GST，酶切鉴定证实该质粒与预期结果一致；DNA测序结果显示人MAPK3蛋白编码区正确插入了原核表达载体中，成功构建了原核表达质粒pGEX-MAPK3GST。见图1。

注：A为RT-PCR扩增MAPK3基因的蛋白编码区，B为EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切原核表达质粒pGEX-4t-1和pMD18-T-MAPK3GST，C为EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切重组原核表达质粒pGEX- MAPK3GST，D为pGEX- MAPK3GST质粒图谱，E为pMD18-T-MAPK3GST DNA测序，F为pGEX- MAPK3GST DNA测序。图1 人MAPK3基因克隆及其原核表达载体pGEX-MAPK3GST构建Fig.1 Cloning of human MAPK3 gene and construction of its prokaryotic expression plasmid pGEX-MAPK3GST

2.2 MAPK3融合蛋白表达、纯化及鉴定

将重组的原核表达质粒pGEX-MAPK3GST导入Rosetta细菌(DE3)中，用IPTG诱导GST-MAPK3融合蛋白表达。结果如图2所示，当细菌被诱导后在70 kDa之上出现了大量的蛋白；破碎菌体后，分别对上清液和沉淀进行变性胶电泳和考马斯亮蓝染色，发现诱导蛋白同时出现在上清和沉淀中；用Glutathione Sepharose 4B琼脂糖凝胶与上清液杂交，获得的蛋白液进行变性胶电泳和考马斯亮蓝染色，在70 kDa之上出现了单一的蛋白条带；蛋白免疫印迹结果显示，该目的条带正是GST-MAPK3融合蛋白。

注：1为Thermo Scientific PageRuler Pierce 26616，2为未诱导的细菌，3为IPTG诱导的细菌，4为菌体破碎后的上清液，5为菌体破碎后的沉淀物，6为纯化的GST-MAPK3融合蛋白。图2 融合蛋白GST-MAPK3的考马斯亮蓝染色及蛋白免疫印迹分析Fig.2 Coomassie bright blue staining and Western blot of the purified fusion protein GST-MAPK3

3 讨论

MAPK家族成员较多，如p38MAPK、JNK等，且不断有新成员加入，这些成员参与了真核细胞的重要信号转导和网络调控，影响多种细胞的生长、增殖、分化、迁移、凋亡及炎症等生理[14]。不同的MAPK具有相似的作用，也存在各自特异的生物学功能[15]。在这些成员中，由于MAPK3与MAPK1在蛋白质一级结构上具有85%的相似性，因此具有诸多类似的生物学功能，两者也通常被归为一类并写成MAPK1/3或者ERK1/2[14-15]。尽管如此，两者之间蛋白结构和生物学功能仍有差异，与分子量42 kDa的MAPK1相比，MAPK3的N-末端多了一段特有的氨基酸序列，使其分子量比MAPK1多出了2 kDa，导致胞质中磷酸化活化的MAPK3入核速度低于MAPK1，因此细胞核内MAPK3整体磷酸化水平低于MAPK1的磷酸化水平，使MAPK3携带细胞增殖信号的能力下降[15]。此外，MAPK3还有许多不同于MAPK1的特异生物学功能，能够诱导脂肪细胞分化、引起肥胖[16]；能诱导破骨细胞，形成和保护N-甲基-D-天冬氨酸诱导的视网膜损伤[17]。因此，除了研究MAPK1/3的共同生物学功能外，非常有必要单独研究MAPK3的生物学功能。为研究MAPK3蛋白在肝脏生理条件下和病理过程中的生物学功能，首先需要获得MAPK3蛋白。为此本课题组通过TRIzol法从人肝细胞中抽提获得总RNA，以此总RNA为模板通过RT-PCR体外扩增获得人MAPK3基因的蛋白编码区，利用DNA测序技术验证体外扩增获得的cDNA片段正是人MAPK3基因的蛋白编码区，且未发生任何突变；随后将该cDNA片段通过限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ/XhoⅠ插入到原核表达载体pGEX-4t-1中，构建重组原核表达质粒pGEX-MAPK3GST；将重组质粒用热激法导入细菌Rosetta中，利用IPTG诱导宿主细菌表达可溶性融合蛋白GST-MAPK3，菌体破碎和高速离心获取含有GST-MAPK3的蛋白混合液，再利用GST标签的特性通过Glutathione Sepharose 4B琼脂糖凝胶亲和层析纯化GST-MAPK3，用考马斯亮蓝法和蛋白免疫印迹法分别验证蛋白纯度及蛋白特异性，最终获得较纯的MAPK3蛋白，为下一步研究MAPK3的生物学功能奠定了基础。

本研究利用了一种常用的、体外有效获取基因片段的技术方法RT-PCR来获取人MAPK3基因蛋白编码区，该技术始于1985年，现已成为当前分子生物学领域应用最广和最热门的一项技术[17-19]。该技术的广泛普及得益于多种性能的Taq DNA聚合酶的开发和创新[20-22]。本研究利用了一种莫罗尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus，MMLV)来源、通过基因改造的可抑制RNA高级结构和错配延伸的反转录酶及高保真长链扩增DNA聚合酶，单次实验就实现了从人肝细胞总RNA中获得了MAPK3基因蛋白编码区。

原核表达是一种大量、快速制备目的蛋白的有效方法，与真核表达和体外无细胞翻译系统相比，其具有目的蛋白表达量多、蛋白制备和纯化程序简单及原材料经济等优点，是有效获取目的蛋白的重要方式之一[23-24]。本研究通过重组原核表达质粒pGEX-MAPK3GST在细菌中大量诱导表达融合蛋白GST-MAPK3，并利用融合蛋白中的GST标签增加目的表达蛋白的水溶性，使原核表达的蛋白不容易形成包涵体，使目的蛋白在自然条件下正确折叠；同时，利用GST标签蛋白与Glutathione Sepharose 4B具有亲和力的特性，通过亲和层析从细菌蛋白混合液中分离纯化MAPK3目的蛋白。

研究表明，MAPK1/3能够促进细胞中角蛋白18(cytokeration 18，CK18)再表达，而表达的CK18可能会反向作用于MAPK1/3，影响其激酶活性，从而反馈性调控细胞生理和细胞活动；另一方面，蛋白激酶C(protein kinase C epsilon，PKC)活性可以调控MAPK1/3的活性[25]，而PKC与CK18的磷酸化具有密切联系，本研究成功克隆人MAPK3基因并获得MAPK3蛋白，可用于体外研究MAPK3对CK18的磷酸化作用。因此，在获得了纯化的MAPK3融合蛋白的基础上，为后续研究MAPK3、PKCε及CK18之间的关系奠定了基础。