PNU介导Seipin调控BV2细胞降解Aβ寡聚体的机制研究*

张捷， 何军， 熊浪， 陈道慧， 彭宁， 黎婷婷， 任真奎,2， 禹文峰， 吴昌学

(1.贵州省第二人民医院 检验科， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳 550004)

阿尔茨海默病(AD)是一种好发于中老年人的痴呆性疾病，其病理表现为细胞外β-淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)聚集形成的老年斑块(senile plaque，SP)、细胞内高磷酸化的tau蛋白组成神经纤维结节(intracellular neurofibrillary tangles，NFTs)、神经元坏死或功能失活及突触受损等[1-2]。已知AD的病理机制有大脑神经元Aβ的异常聚集、神经炎症、氧化应激和自噬功能失调等[3-4]。随着对AD发病机制研究的不断深入，科学家提出有效抑制大脑内Aβ的异常聚集，可能是治疗AD的一个有效靶点[5-6]，但其疗效也一直存在争议。因此，寻找有效的小分子化合物或药物调控清除脑内Aβ寡聚体对AD的治疗具有一定的意义。PNU是α7烟碱型乙酰胆碱受体的激动剂，研究认为PNU在AD的动物模型、急性肺损伤模型及LPS诱导的神经炎症模型等皆有保护作用，但是其确切的分子机制尚不清楚[7-8]。本课题组的前期研究发现，PNU能够激活PI3K / Akt / mTOR自噬信号通路，且伴随着Aβ水平的降低[9]。Seipin是一个定位于内质网上的多次跨膜蛋白，对脂滴的形态具有重要调控作用[10-11]，其突变导致2型先天脂肪营养不良；Seipin在中枢神经系统中高表达，在AD和缺血性脑卒中细胞、动物模型中均有研究报道[12]。研究发现Seipin可以调控细胞的自噬水平，并在Seipin N88S / S90L突变体转基因小鼠中亦检测到自噬的激活，突变体细胞内免疫荧光显示自噬标志物微管相关蛋白1轻链3 (LC3)的亚细胞位置与突变的Seipin蛋白高度重叠[13-14]，提示Seipin与自噬存在联系。因此，本研究拟用Aβ处理的BV2小胶质细胞(简称BV2细胞)模型探讨PNU对BV2细胞Seipin蛋白表达、自噬功能，并探讨分析二者之间相互调控的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

BV2细胞购于中科院上海细胞库，PNU282987和Aβ药物购自Sigma公司，LC3和Beclin-1抗体购自美国CST公司，Aβ抗体购自Gentex公司，Seipin抗体购自美国Abcam公司。Seipin shRNA慢病毒及阴性对照慢病毒购自上海吉凯基因生物公司，RNAi靶序列为GTAGAACTCTACTCTGACTAT，阴性对照插入序列为TTCTCCGAACGTGTCACGT。

1.2 研究方法

1.2.1BV2细胞的培养 将购买的BV2细胞冻存管放入之前预热好的37 ℃恒温水浴锅中融化，避免慢融；将管内的细胞悬液转入含完全培养基的15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min；丢弃上清液，再加入培养基重悬细胞，之后接种于培养瓶中，轻轻摇动培养瓶使细胞较散在地铺于培养瓶底面，培养瓶置于5 % CO2、37 ℃的培养箱中进行培养；根据镜下细胞状态更换细胞培养基。

1.2.2CCK8法筛选Aβ最适造模浓度 Aβ作为诱导AD体外模型的药物，用CCK-8法检测不同浓度Aβ(0、0.1、1、5、10及30 μmol/L)对BV2细胞的损伤作用，参照实验室前期实验所使用的方法筛选Aβ最适浓度，处理24 h。

1.2.3病毒感染实验 用Seipin shRNA慢病毒及阴性对照慢病毒感染BV2细胞，参照实验室前期实验所使用的方法，培养观察细胞荧光，获得阴性对照细胞与Seipin低表达细胞。

1.2.4细胞分组 根据1.2.2获得的造模浓度，将细胞分为正常组(未做任何处理)和Aβ组(Aβ孵育24 h)，采用Western Blot检测Aβ处理24 h细胞的Seipin蛋白表达水平。为了探索PNU对Aβ的抑制作用，将细胞分组为Aβ组(Aβ处理24 h)和Aβ+PNU组(5 μmol/L PNU处理细胞18 h、再加入Aβ孵育24 h)，观察Aβ的表达情况；为了探索PNU对Seipin及自噬的影响，设置正常组(未做任何处理)与PNU组(5 μmol/L PNU处理细胞18 h)，观察Seipin以及LC3和Beclin-1的表达情况；为了验证慢病毒对Seipin的敲低效果，设置阴性对照组(非靶向性慢病毒)和si-Seipin组(靶向Seipin 的siRNA慢病毒)，用Western blot检测Seipin表达水平；为了探索Seipin在PNU激活自噬及抑制Aβ过程中的重要性，设置阴性对照+Aβ组、阴性对照+Aβ+PNU组、si-Seipin+Aβ+PNU组，采用Western blot检测Aβ和LC3的表达水平。

1.2.5Western Blot检测蛋白表达水平 将上述各组细胞提取的蛋白样品与适量5×Buffer混匀，沸水变性10 min，室温冷却备用；用12% SDS-PAGE凝胶以40 mA电流进行电泳，PVDF膜在冰浴中转膜2 h，封闭液室温封闭1 h, TBST洗涤2次，5 min/次；将实验所用一抗4 ℃孵育过夜，之后TBST洗涤3次，5 min/次；再以相应二抗室温孵育2 h，TBST洗涤3次，10 min/次，用ECL发光液进行显色。用曝光仪获取图像结果，并用ImageJ计算灰度值，总蛋白以β-actin 为内部参照进行统计学分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 CCK8法筛选Aβ最适造模浓度

用不同浓度的Aβ处理BV2细胞，CCK8结果显示：随着Aβ浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。与0 μmol/L相比，细胞经10 μmol/L的Aβ处理后其细胞存活率显著下降30%；而在其他浓度下细胞受损较轻或较严重，均不适于诱导AD细胞模型来进行相关研究观察。因此，选择浓度为10 μmol/L Aβ作为建模浓度(图1)。

注：与0 μmol/L比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01。图1 不同浓度Aβ处理的细胞存活率Fig.1 The survival rate of cells treated with different concentrations of Aβ

2.2 Aβ处理后BV2细胞中Seipin蛋白水平

在Aβ诱导的BV2细胞模型检测Seipin蛋白的表达，结果显示，经Aβ处理后BV2细胞中Seipin蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：(1)与正常组比较， P<0.05。图2 各组BV2细胞中Seipin蛋白表达Fig.2 The expression of Seipin in each group

2.3 Aβ作用BV2细胞经PNU处理后Aβ表达

为了验证PNU能抑制Aβ表达，BV2细胞经PNU处理18 h后，再用Aβ处理24 h；结果显示，与Aβ组比较，PNU能够减少Aβ的水平，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.4 BV2细胞经PNU处理后Seipin表达

为了探索PNU对Seipin表达的影响，在BV2细胞中加入PNU处理。结果显示，与正常组比较，PUN组BV2细胞中Seipin蛋白表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：(1)与Aβ组比较， P<0.05。图3 PNU处理后各组BV2细胞Aβ蛋白表达Fig.3 The expression of Aβ treated by PNU in each group

注：(1)与正常组比较，P<0.05。图4 PNU处理后各组BV2细胞中Seipin蛋白表达Fig.4 The expression of Seipin treated by PNU in each group

2.5 BV2细胞经PNU处理后自噬相关蛋白表达

结果显示，与正常组比较，PNU组BV2细胞自噬相关蛋白LC3和Beclin-1表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

注：(1)与正常组比较， P<0.05。图5 PNU处理后各组BV2细胞中LC3和Beclin-1蛋白表达Fig.5 The expression of LC3 and Beclin-1 treated by PNU in each group

2.6 Seipin低表达细胞的鉴定

为了探索si-Seipin慢病毒对Seipin表达的影响，BV2细胞经si-Seipin慢病毒处理后，检测到Seipin蛋白表达降低(P<0.05)。见图6。

注：(1)与NC组比较， P<0.05。图6 si-Seipin慢病毒对BV2细胞中Seipin表达的影响Fig.6 The effect of si-Seipin lentivirus on Seipin expression

2.7 低表达Seipin后LC3和Aβ的表达

结果显示，与NC+Aβ组相比较，NC+Aβ+PNU组BV2细胞中Aβ明显降低、LC3-Ⅱ明显升高(P<0.01)；与NC+Aβ+PNU组比较，si-Seipin-Aβ+PNU组BV2细胞中Aβ明显升高、LC3-Ⅱ明显降低(P<0.01)。见图7。

3 讨论

痴呆类神经退行性疾病的特征是神经系统的进行性损害，例如导致认知能力下降的脆弱神经元群体的选择性丧失。尽管每年都有报道全世界有数以百万计的人受到影响，但仍然没有药物能够阻止该疾病的过程或减慢疾病的进展。AD患者的神经元死亡与大脑内聚集的错误折叠蛋白Aβ有关[15-17]。机体有两种主要的降解途径——泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体途径，可以清除细胞中不需要的或错误折叠的蛋白质，以防止其积累并维持细胞的功能[18-19]。随着年龄的增长，蛋白酶体的降解和自噬功能显著降低，因此，脑内大量的、具有神经毒性的Aβ和tau蛋白聚集体异常蓄积[20]。自噬是AD病理机制中研究的热点内容之一，PNU作为其常用的研究药物，也发现与自噬的调节密切相关，但是其具体的调控机制尚未完全清楚[21]。近年来，Seipin蛋白在神经系统疾病中的研究越来越多，被发现与细胞内一些功能密切相关，参与内质网应激通路的调控[22]。其次，报道也提出Seipin与自噬调控有关，此外，小胶质细胞是神经系统驻留的免疫细胞，具有吞噬、清除脑内异常代谢废物或蓄积物质的功能[23-24]。探讨PNU增强BV2细胞自噬途径介导Aβ寡聚体的清除机制，对AD的有效治疗具有重要意义。

注：(1)与NC+Aβ+PNU组比较，P<0.01；(2)与NC+Aβ组比较，P<0.01。图7 各处理组Aβ和LC3蛋白表达水平Fig.7 The expression of Aβ and LC3 in each group

本研究中，BV2细胞用浓度为10 μmol/L的Aβ寡聚体处理构建AD细胞模型。经Aβ造模后细胞Seipin蛋白水平下降，在病理状态下Seipin蛋白表达降低，提示Aβ抑制了BV细胞Seipin蛋白的表达。PNU处理能够使细胞内Aβ蛋白减少，证明PNU通过降低Aβ发挥一定的神经保护作用。以上结果与之前研究报道一致[9]。为了阐明PNU的作用机制，在单独加PNU处理的情况下，Seipin蛋白增加，自噬蛋白LC3和Beclin-1也增加。与之前PNU处理后能改善AD小鼠的学习记忆功能，Aβ聚集形成的斑块减少，并发现了自噬溶酶体的存在，及Beclin-1表达增加的研究结果具有一致性[25]。本研究发现Seipin蛋白水平在PNU的处理下能够上调，且在Aβ单独处理下Seipin蛋白水平降低，此外，PNU能促进Aβ的降解，据此，推测PNU发挥神经保护作用的机制可能是上调Seipin蛋白，进而增强Seipin蛋白介导的自噬并降解Aβ寡聚体。为了进一步论证以上猜测，本研究进一步对BV2细胞进行慢病毒感染实验敲低Seipin蛋白，再将该细胞与未干扰的细胞均进行Aβ和PNU处理，结果显示Seipin缺少后与正常细胞相比其Aβ升高，LC3-Ⅱ降低，提示PNU的保护效应一定程度上依赖于Seipin的存在。

综上所述，Aβ处理BV2细胞后Seipin降低，PNU能够抑制Aβ的表达，PNU上调Seipin增强自噬降解Aβ是该效应的可能机制。