硒结合蛋白1基因沉默对巨噬细胞硒蛋白表达水平的影响*

贾义， 代杰， 杨洁， 张亮亮， 曾柱

(贵州医科大学 生物与工程学院， 贵州 贵阳 550025)

硒是人体和哺乳动物所必需的微量元素，具有抗氧化、提高红细胞携氧能力及提高人体免疫力、解毒排毒抗污染等作用，亦与肿瘤等多种疾病相关[1]。硒的生物功能主要是通过硒蛋白实现，通过实验和生物信息学的方法已经从人类基因组中发现了25种硒蛋白[2]。硒结合蛋白1(selenium-binding protein 1，SBP1)是一种结合硒原子的含硒蛋白，于1989年被发现，主要定位于细胞质和细胞核[3-5]；与正常组织器官相比，癌组织中的SBP1表达水平存在显著下降甚至丢失[6-7]，比如胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌和乳房癌等。缺氧诱导因子(hypxia-inducible factor-lalpha，HIF-la)参与了肿瘤血管的生成和能量代谢，而SBP1蛋白表达水平的明显下降增加了HIF-1a的稳定性[8]，因此，SBP1可能成为潜在的抗肿瘤靶点[9]。巨噬细胞具有吞噬和趋化性迁移的作用[10-11]，是人体非特异性免疫的重要一员，在肿瘤增殖、侵袭、转移中发挥重要作用[12]，巨噬细胞在原发和继发肿瘤中被称为肿瘤相关巨噬细胞，是肿瘤间质中细胞数量最多的群体[13]。研究发现，硒蛋白参与了免疫功能的调节，硒蛋白K(selenoprotein K，SELENOK)敲除可以影响T细胞的增殖和迁移[14]、硒蛋白T(selenoprotein T，SELENOT)参与了免疫相关细胞因子的表达调控[15]、蛋氨酸亚砜还原酶B1(methionine sulfoxide reductase B1，MSRB1)参与了巨噬细胞中抗炎症因子的表达[16]；此外，硒蛋白S(selenoprotein S，SELENOS)、硒蛋白F(selenoprotein F，SELENOF)和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)也参与了免疫应激[17]。考虑到巨噬细胞和SBP1在癌症发展中的作用以及硒蛋白对免疫功能的调节，沉默SBP1基因是否对巨噬细胞中硒蛋白的表达具有调节作用是一个值得研究的方向。本项目将单核细胞株THP-1分化为M0型巨噬细胞，检测SBP1基因沉默对巨噬细胞硒蛋白表达水平的影响，为SBP1参与调节巨噬细胞功能提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1细胞来源 人单核细胞株THP-1购于美国模式培养物集存库(american type culture collection, ATCC)。

1.1.2主要试剂和仪器 RPMI 1640培养基、胎牛血清、双抗购于美国Gibco公司，佛波酯购于北京索来宝科技有限公司，引物序列由上海生工生物合成，Lipofectmine 3000、Trizol购于美国Invitrogen公司，PCR试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix kit购于美国Thermo 公司，SBP1和GAPDH抗体购于美国Santa Cruz公司。CO2培养箱、实时荧光定量PCR仪购于美国Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 THP-1细胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基在37 ℃、5% CO2培养箱内培养，用50 μg/L的佛波酯诱导培养48 h后获得M0巨噬细胞。

1.2.2基因沉默 将M0巨噬细胞接种于6孔板中，分为空白对照组(C组，含转染试剂)、阴性对照组(NC组, 含转染试剂和阴性对照引物)和沉默组(Si组, 含转染试剂和SBP1 siRNA引物)，培养24 h后根据Lipofectmine 3000转染试剂说明对细胞进行转染，转染24 h或48 h后收集细胞用于后续检测。SBP1 siRNA上下游引物序列分别为5′-CUUGGAGGCACCAAGAAAUTT-3′(sense)，5′-AUUUCUUGGUGCCUCCAAGTT-3′(antisense)。阴性对照上下游引物序列分别为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(sense)，5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′(antisense)。

1.2.3SBP1和硒蛋白基因表达检测 使用Trizol试剂从M0巨噬细胞提取总RNA，用随机引物和逆转录酶合成cDNA，按照试剂盒说明进行实时荧光定量PCR反应。SBP1和硒蛋白(GPX1、SELENOH、SELENOK、SELENOS、SELENOT、SELENOV、SELENOW、TXNRD3和SEPHS2)的引物序列见表1。PCR反应条件参照SYBR Green PCR Master Mix kit设置，以GAPDH基因为内参，利用2-ΔΔCT方法计算目标基因的表达水平[18]。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Tab.1 List of primers for real-time PCR

1.2.4SBP1蛋白表达检测 收集处理好的细胞后用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取60 μg样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；转膜后经一抗孵育，SBP1和GAPDH抗体稀释比例分别为1 ∶1 000和1 ∶3 000。二抗孵育后用ECL发光液进行检测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 SBP1 mRNA表达水平

基因转染实验结果表明，在SBP1基因沉默巨噬细胞中，SBP1 mRNA表达水平被抑制了76%左右，与对照组(C组)相比差异具有统计学意义(P<0.001，图1)，表明巨噬细胞中SBP1的mRNA表达被抑制。

注：(1)与C组比较，P<0.001。图1 SBP1基因沉默后巨噬细胞SBP1 mRNA的表达水平Fig.1 SBP1 mRNA expression level in SBP1-gene silencing macrophage

2.2 SBP1蛋白表达水平

结果显示，在SBP1基因沉默的巨噬细胞中， SBP1蛋白水平被抑制了50%，与C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。表明巨噬细胞中SBP1蛋白的表达被抑制。

注：(1)与C组比较，P<0.05。图2 SBP1基因沉默后巨噬细胞SBP1蛋白表达水平Fig.2 SBP1 protein expression level in SBP1-gene silencing macrophage

2.3 SBP1基因沉默对巨噬细胞中硒蛋白mRNA表达水平的影响

硒蛋白基因表达检测结果显示，在SBP1基因沉默的巨噬细胞中，硒蛋白SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK和SELENOSmRNA表达明显上调(P<0.001)，硒蛋白MSRB1、SELENOT和SELENOWmRNA表达明显下调(P<0.01)，硒蛋白SELENOVmRNA表达量不变(P>0.05)。见图3。

注：与C组比较，(1)P<0.001,(2)P<0.01。图3 SBP1基因沉默后巨噬细胞中硒蛋白mRNA表达水平的变化Fig.3 Changes of selenprotein mRNA levels in macrophages after SBP1 gene silencing

3 讨论

硒主要以硒蛋白的形式存在于体内，研究发现，硒蛋白在免疫反应等多方面发挥重要的生理作用[19]。而巨噬细胞是非特异性免疫系统中主要的效应细胞，可通过多种途径影响其他免疫细胞的功能活性，对于特异性免疫应答也起着重要的作用[19]。近年来，研究发现硒蛋白对巨噬细胞功能具有重要的调节着作用[19]。为了进一步研究SBP1对巨噬细胞中部分硒蛋白的影响，本实验以单核细胞株THP-1诱导的巨噬细胞为研究对象，分析了SBP1基因沉默对硒蛋白SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK、SELENOS、MSRB1、SELENOT、SELENOW和SELENOVmRNA表达的影响，这对深入了解SBP1是否参与巨噬细胞的免疫功能具有重要意义。

SELENOK、SELENOS、SELENOT、SELENOW是内质网定位硒蛋白，在钙稳态调节、氧化应激和内质网应激调节等方面发挥重要作用，均参与了免疫功能的调节[14-15,17,20]。SELENOH通过氧化还原作用参与人体内各种生理作用[21]，可以调节癌细胞的增殖[22]，在LPS诱导的小鼠巨噬细胞中表达量下降[23]；MSRBl位于细胞核与细胞质，具有氧化还原活性，可调节巨噬细胞中抗炎因子的表达[16]；GPX1具有抗氧化作用，是谷胱甘肽过氧化物酶家族成员，GPX1敲除小鼠可以导致巨噬细胞数量减少[24]；TXNRD3是硫氧还蛋白还原酶，在硫氧还蛋白存在时，具有氧化还原活性，参与胰岛素中炎症的调节。研究表明，GPX1与TXNRD可以发挥互补作用，在调节免疫应答平衡过程中发挥关键作用；GPX1与SELENOW之间存在一定的代偿性，SELENOW表达降低可导致GPX1表达升高[25]。这与本文的研究结果一致。人结肠直肠癌或乳腺癌中SBP1的过表达可以导致GPX1酶活的减少，GPX1表达增加会导致SBP1的转录和翻译抑制，表明GPX1和SBP1表达水平呈负相关[11]。本文结果显示巨噬细胞中SBP1被抑制后，GPX1表达水平升高。

根据本文的研究结果，可以推测SBP1与部分硒蛋白之间存在一种补偿机制，当SBP1表达降低时，SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK和SELENOSmRNA的表达升高，而SBP1与MSRB1、SELENOT和SELENOW的表达存在正相关性。因此，探讨SBP1基因沉默对巨噬细胞中硒蛋白表达水平的影响，研究SBP1与硒蛋白组之间可能存在的补偿机制，为SBP1参与巨噬细胞免疫功能的调节提供了实验依据。

总之，SBP1基因沉默的巨噬细胞，硒蛋白SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK和SELENOSmRNA表达上调，硒蛋白MSRB1、SELENOT和SELENOWmRNA表达下调，硒蛋白SELENOVmRNA表达不变。SBP1基因沉默可以调节巨噬细胞硒蛋白的表达。