裂褶菌极端嗜盐木聚糖酶ScXyn22的性质及对全麦面包品质的影响

刘玉春，张维清，任 菲，郭 超，王 超

（国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037）

木聚糖酶（EC 3.2.1.8）是一类能够水解木聚糖主链-1,4-糖苷键的水解酶。目前已报道的木聚糖酶大多为糖苷水解酶第10（GH10）和11（GH11）家族。木聚糖酶的酶学性质决定了其应用领域，GH11家族木聚糖酶最适pH值为2.0～9.0，最适温度在35～85 ℃之间，如棘孢木霉（）来源的GH11家族木聚糖酶Xyn11A最适pH值和最适温度分别为5.0 ℃和50 ℃；出芽短梗霉（）来源的木聚糖酶最适pH值为4.0，最适温度为30～50 ℃，具有在烘焙和低聚木糖制备领域的应用价值。嗜盐/耐盐木聚糖酶在海产品、腐乳、面制品等高含盐量食品的加工生产中有很大的应用潜力。嗜盐/耐盐木聚糖酶一般是指在高盐浓度下（0.5～4.5 mol/L）保持有催化活性的木聚糖酶，己报道的嗜盐/耐盐木聚糖酶中以GH10家族居多，而GH11家族则非常少。

全麦粉含有丰富的膳食纤维、维生素、矿物质；但全麦食品存在口感质地及消费者接受度低等缺点。添加酶制剂可有效改善全麦食品品质，如木聚糖酶能够将全麦粉中的不溶性半纤维素转化为可溶性低聚糖，添加子座木霉（）来源的木聚糖酶Xyl1能够增加小麦粉面包和全麦面包的柔软度和体积；添加链霉菌（sp. S27）来源的重组木聚糖酶（xynBS27）同样能够改善面包品质，即降低硬度，提高体积和还原糖含量。谷氨酰胺转氨酶能够消除全麦中纤维等对面团强度的影响，使得面团微观结构均匀连续，变全麦面团特性及微观结构。

课题组筛选获得1 株能够在半纤维素和木质素基质上生长良好裂褶菌（），该菌株能够分泌表达完整的半纤维素降解酶系。本研究克隆该裂褶菌来源GH11家族木聚糖酶基因，完成在毕赤酵母中的异源表达和性质研究，并分析该酶对全麦面包品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

裂褶菌DB01为本实验室筛选并保存菌株；大肠杆菌1 北京全式金生物技术有限公司；毕赤酵母GS115、载体pPIC9K 美国Invitrogen公司。

全麦粉、酵母粉（安琪酵母）、高筋小麦粉 新良集团；白砂糖 太古炼糖厂有限公司；精制盐 中国盐业总公司；奶粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司；黄油 新西兰Anchor（安佳）乳品公司。

1.2 仪器与设备

DK-8D电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司；MQD-SIR单层小容量振荡培养箱 上海旻泉仪器有限公司；离心机 德国Eppendorf公司；SynergvHT酶标仪 美国BioTek公司；电泳仪、凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；TA.XT plus质构仪 英国SMS公司。

1.3 方法

1.3.1 总RNA的提取

玉米皮纤维诱导培养裂褶菌参照刘玉春等方法，在30 ℃条件下培养48 h，收集菌体，加入液氮研磨体提取mRNA，mRNA的提取与反转录按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 木聚糖酶基因的克隆表达

根据木聚糖酶基因的序列信息（GenBank Accession No. EFJ03564.1），设计毕赤酵母表达引物（R I_X22F：5’-CC GGAATTCTCGCCGCTCAATGCGACG-3’；I_X22R：5’-CGCTAGCGGCCGCGTGACCG TGATGGTCGCA-3’），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR扩增参数：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，63 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min；经45 个循环后68 ℃延伸5 min。扩增产物经限制性内切酶酶切后与载体pPIC9K连接，转化大肠杆菌，测序确定得到重组质粒pPIC9K-。

应用限制性内切酶I将重组质粒pPIC9K-线性化后电转化毕赤酵母感受态细胞GS115。挑取单菌落诱导培养，选取木聚糖酶活力最高的重组菌株进行摇瓶发酵，30 ℃、200 r/min诱导120 h后，10 000 r/min离心收集上清液。发酵方法及培养基的配制参照毕赤酵母发酵手册（Version B, 053002, Invitrogen）操作。

将发酵液12 000 r/min离心10 min，上清液通过硫酸铵分级沉淀（硫酸铵为40%～60%时沉淀的蛋白质）浓缩重组蛋白；浓缩液4 ℃透析16 h，透析液为20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）。透析后的酶液上样于预先平衡好的Q-Sepharose离子交换柱，上样后用0～500 mmol/L NaCl溶液（20 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.0）线性洗脱（12 个柱体积），流速为1 mL/min，收集洗脱液。合并有酶活力的收集液，用20 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 5.0）4 ℃透析过夜。收集液进行活力测定和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.3Xyn22酶活力和蛋白含量的测定

木聚糖酶活力测定参照3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法，并作部分修改。取900 μL 1 g/100 mL底物（桦木木聚糖）在37 ℃预热后，加入100 μL适当稀释的酶液；在37 ℃保温10 min；加1.5 mL DNS终止反应，沸水煮5 min，冷却后测540 nm波长处吸光度。1 个酶活单位（U）定义为每分钟分解底物生成1 μmol还原糖所需的酶量。以牛血清蛋白为标准，参照Lowry等的方法测定蛋白含量。

1.3.4Xyn22酶学性质分析

最适温度的测定：以50 mmol/L pH 5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制底物，分别在不同温度下按照标准方法测定重组木聚糖酶的活力，以酶活力最高点为100%。温度稳定性：将酶液适当稀释后分别置于不同温度下处理30 min，然后将酶液置于冰水中冷却30 min，以未经处理的酶液作为对照，测定残余酶活力，最后计算残余酶活力占对照酶活力的百分比。

最适pH值的测定：在最适温度条件下，使用不同pH值及不同体系的缓冲液（0.1 mol/L Gly-HCl缓冲溶液，pH 1.5～3.0；0.1 mol/L柠檬酸缓冲液，pH 3.0～7.0；0.1 mol/L NaHPO-NaHPO缓冲液，pH 6.5～8.0；0.1 mol/L Tris-HCl缓冲溶液，pH 7.5～8.5；0.1 mol/L Gly-NaOH缓冲溶液，pH 8.5～10.5）配制底物（1%），然后按照标准方法测定酶活力，以酶活力最高点作为100%。pH值稳定性的测定：用上述不同的pH值缓冲液分别稀释（稀释5 倍体积）纯酶液静置30 min，按标准方法测定酶活力，以未经处理的酶液作为对照，最后计算残余酶活力的百分含量。

1.3.5Xyn22比活力和动力学参数的测定

在最适反应条件下测定Xyn22的活性，计算比活力。动力学参数的测定：配制不同浓度的底物，在最适温度和最适pH值下测定酶活力，反应时间为5 min，通过“Grafit”软件计算出和值。

1.3.6Xyn22底物特异性及NaCl浓度对木聚糖酶活性的影响

以0.5%桦木木聚糖、0.2%小麦阿拉伯木聚糖、0.5%-燕麦葡聚糖、0.5%槐豆胶、0.5%微晶纤维素、0.5%羧甲基纤维素为底物测定Xyn22的水解活性，用DNS法测定Xyn22对不同底物的水解活性，以0.5%桦木木聚糖反应所得计100%。

NaCl浓度对酶活性的影响：不同浓度NaCl（1～5 mol/L）条件下，在最佳pH值和温度下进行活性测定。

1.3.7 水解产物薄层色谱分析

在200 μL的0.5 g/100 mL桦木木聚糖中加入6 U纯化后的Xyn22，50 ℃、pH 5.0条件下分别反应5、10、20、40 min和60 min，将反应体系置于沸水浴5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液点样于薄层色谱板，在展开剂（正丁醇∶水∶乙酸=2∶1∶1（/））中展开2 次，置于显色剂（浓硫酸-甲醇（95∶5，/）浸泡后立即烘干显色。

1.3.8 蛋白酶抗性分析

Xyn22在模拟胃肠环境中的稳定性分析参照Huang等的方法进行，将纯化后Xyn22酶液与模拟胃液（200 mmol/L Gly-HCl和200 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，含有2.0 mg/mL NaCl和2.0 mg/mL胃蛋白酶，用HCl或者乙酸钠依次调整pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0）和模拟肠液（1 mg/mL木聚糖底物，10 mg/mL胰蛋白酶溶液，pH 6.8）按照质量比20∶1混合，于37 ℃恒温水浴，每隔一定时间（5、10、20、30、60、90、120 min）取样测定酶活力，以未经胰蛋白酶溶液消化处理的酶液活力为100%。

1.3.9Xyn22对全麦面包品质影响

全麦面包材料包括全麦粉-高筋面粉混合粉（1∶1）250 g、酵母2.8 g、盐5 g、糖18 g、奶粉8 g、黄油10 g、水210 mL，Xyn22添加量为0、75、150、300、450 U/kg（按全麦粉-高筋面粉混合粉质量计），全麦面包制作工艺参照王娜等方法。面包比容测定：参照GB/T 20981—2007《面包》排米法测定比容，采用油菜籽替代大米。面包质构性质采用质构仪的TPA模式测定。将面包冷却放置12 h，制成厚度25 mm的切片，参照王娜等方法采用面包片中心紧邻部位进行测试。探头为圆柱形平底探头（TA/36R），直径36 mm；测前速率3 mm/s，下压中速率1 mm/s，下压后速率5 mm/s，触发力20 g，压缩时间5 s；收回距离10 mm。

1.4 数据统计

实验结果均为平均值，并进行3 次平行实验，采用SPSS、Microsoft Excel软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 ScXyn22的克隆和表达结果

基因全长687 bp，编码228 个氨基酸和1 个终止密码子。序列分析显示，该酶N端具有一个17 个氨基酸残基组成的信号肽序列。图1为Xyn22与已报道嗜盐/耐盐木聚糖酶氨基酸序列对比分析，包括骆驼瘤胃宏基因组（MG595703.1，53%）、（Q12562.1，60%）、（ADF53358.1，26%）和（ADQ57411.2，26%）来源的嗜盐/耐盐木聚糖酶。序列比对分析发现Xyn22具有GH11家族木聚糖酶催化起关键作用2 个保守的谷氨酸残基，即第118位和第215位。

图1 裂褶菌木聚糖酶ScXyn22与其他来源的嗜盐/耐盐木聚糖酶氨基酸序列分析Fig. 1 Multiple amino acid sequence alignment of ScXyn22 with other halophilic xylanases

构建重组表达载体后转化毕赤酵母宿主菌，筛选酶活力最高重组菌株的进行诱导表达。摇瓶发酵后离心收集上清液，经硫酸铵分级沉淀后应用阴离子交换层析柱一步纯化得到电泳级纯酶（Xyn22），回收率为82.5%，纯化倍数为1.3 倍。Xyn22在电泳胶上呈单一条带，其分子质量为22.41 kDa（图2），与预测分子质量一致。

图2 ScXyn22的SDS-PAGE检测Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the purified ScXyn22

2.2 ScXyn22酶学性质分析

已报道GH11家族木聚糖酶最适pH值一般在6.5～7.5，大多数真菌GH11木聚糖酶具有较强的耐酸性，Xyn22最适pH值为4.5，为酸性木聚糖酶（图3A）。Xyn22最适pH值低于大多数真菌GH11木聚糖酶，如木聚糖酶Xyn11A（pH 5.0）、木聚糖酶和木聚糖酶r-ec-XylMh（pH 6.0），但高于骆驼瘤胃宏基因组来源木聚糖酶XylCMS木聚糖酶（pH 4.0）和木聚糖酶（pH 4.0）。此外，Xyn22在pH值为3.0～8.5时保温30 min，残余酶活力保持在70%以上，当pH值高于8.5时，稳定性迅速降低，显示出较好的耐酸性（图3B）；优于甘蔗渣堆肥转录组文库来源的木聚糖酶MetXyn11（pH 6.0～9.0）。Xyn22具有较好的耐酸性，显示其在食品等领域具有潜在应用价值。

Xyn22的最适反应温度为55 ℃；当反应温度高于60 ℃时，Xyn22酶活力迅速降低（图 3C）。目前报道大多数真菌木聚糖酶的最适温度在45～60 ℃，如来源木聚糖酶（50 ℃）和木聚糖酶（55 ℃）。Xyn22在55 ℃及以下保持稳定，在55 ℃时保温30 min剩余酶活力为83.45%（图3D）。面包制作过程中的面团醒发温度为35～38 ℃，因此在中温条件下具有良好活性和稳定性的木聚糖酶更加适用于烘焙行业。

图3 ScXyn22的最适pH值（A）、pH值稳定性（B）、最适温度（C）和温度稳定性（D）Fig. 3 Optimal pH (A), pH stability (B), optimal temperature (C), and thermostability (D) of ScXyn22

2.3 ScXyn22底物特异性和水解特性

不同来源木聚糖酶的底物特异性有所不同，而具有多种底物活性可以扩展酶的应用范围。Xyn22对桦木木聚糖、小麦阿拉伯木聚糖和燕麦-葡聚糖有降解作用，对槐豆胶、羧甲基纤维素、微晶纤维素均没有表现出水解活性（表1）。Xyn22水解桦木木聚糖比活力为（5 964.1±429.4）U/mg，水解小麦阿拉伯木聚糖比活力为（12 304.3±1 250.2）U/mg，水解-燕麦葡聚糖比活力为（1 135.8±158.8）U/mg。对于相同底物，Xyn22比活力高于来源Xyn11A（小麦阿拉伯木聚糖727.6 U/mg、桦木木聚糖484.5 U/mg）和来源的木聚糖酶XylP（桦木木聚糖4 700 U/mg、阿拉伯木聚糖2 515 U/mg）。

Xyn22水解桦木木聚糖动力学参数为（3.25±0.27）mg/mL，为（1 288±9.14）μmol/（min·mg）。Xyn22水解桦木木聚糖产物分析见图4，在37 ℃及最适pH值条件下，保温60 min。可以看出，水解产物为木二糖、木三糖、木四糖、木五糖为主的木寡糖，没有木单糖产生，该酶为内切型木聚糖酶。

表1 ScXyn22对不同底物的降解活性Table 1 Degrading activity of ScXyn22 toward different substrates

图4 ScXyn22水解桦木木聚糖产物分析Fig. 4 Analysis of hydrolysis products of birch xylan with ScXyn22

2.4 NaCl浓度对ScXyn22活性影响

在高NaCl浓度（0.5～5 mol/L）的反应体系中能够保持催化活性的木聚糖酶为嗜盐/耐盐木聚糖酶。由图5可以看出，NaCl浓度能够显著影响Xyn22活力，但对于不同底物存在差异。当Xyn22催化水解桦木木聚糖时，NaCl浓度在1～4 mol/L之间能够显著增强酶活力，并随NaCl浓度升高而增高，Xyn22活力分别提高到1.64、2.13、2.31、2.39 倍；当NaCl浓度达到5 mol/L时，酶活力开始降低为原始酶活力的2.3 倍。本研究木聚糖酶Xyn22的嗜盐/耐盐优于Wang Guozeng等报道的sp.来源的碱性木聚糖酶XynSL3，该酶在含有3 mol/L的NaCl反应体系中，酶活力能够达到最适条件下的60%；同时也优于Menon等报道来源的碱性木聚糖酶，其在2.5%～7.5%的NaCl反应体系中时，酶活力会在160%～120%范围变化。Xyn22性质与Ghadikolaei等报道的骆驼瘤胃宏基因组来源的GH11家族极端嗜盐木聚糖酶XylCMS相似，该酶在37 ℃时3、4、5 mol/L NaCl的反应体系中酶活力分别提高了2.4、2.8 倍和2.7 倍，但其最高比活力较低，为2 170 U/mg。

当以小麦阿拉伯木聚糖作为底物时，NaCl能够增强Xyn22催化活力，NaCl浓度在1～5 mol/L之间酶活力分别为原始酶活力的1.21、1.46、1.58、1.48、1.16 倍；但NaCl会降低该酶对-燕麦葡聚糖的水解活性，NaCl浓度在1～5 mol/L之间酶活力分别为原始酶活力的19.31%、47.72%、55.97%、45.99%、38.18%，已有研究显示木聚糖酶蛋白的疏水性和等电点能够影响酶的盐适应性，酶蛋白的表面酸性氨基酸残基的增加能够提高溶解性，而负电荷间的排斥力促进酶蛋白适应高盐环境，因此该现象可能是因为高盐浓度缓冲体系会改变酶蛋白的部分结构，影响其对非最适底物的结合，降低了酶的催化活性。NaCl是食品中不可缺少的成分，如：面制品、海产品、腐乳、酱油等高含盐量的食品，因此嗜盐/耐盐的木聚糖酶在高含盐食品加工生产中有很大的应用潜力。该结果显示Xyn22在食品生产中具有很好的应用潜力。

图5 NaCl浓度对ScXyn22酶活性的影响Fig. 5 Effect of NaCl concentration on the activity of ScXyn22

2.5 蛋白酶对ScXyn22活性影响

当被应用于饲料添加剂时，木聚糖酶需要具有一定的蛋白酶抗性。模拟人工肠液环境下，Xyn22对胰蛋白酶具有较强抗性，在20 min内的剩余酶活力为81%，在120 min后剩余酶活力65.77%（图6）；但该酶不具有胃蛋白酶抗性，酶活力迅速降低，这与var. k11来源的木聚糖酶Xyn10相似，对胰蛋白酶具有较好抗性，但胃蛋白酶处理后酶活性几乎完全丧失。研究显示，酶的蛋白酶抗性与其一级结构、糖基化位点等因素相关，如sp. MEY-1来源木聚糖酶XYL11B具胰蛋白酶和和胃蛋白酶抗性。因此，可应用理性设计或定向进化技术对酶进行分子改造，以改善酶学性质、提高蛋白酶抗性。

图6 ScXyn22的蛋白酶抗性Fig. 6 Protease resistance of ScXyn22

2.6 ScXyn22对全麦面包比容影响

由图7可知，面包比容随Xyn22添加量的增加先增大后降低，当Xyn22添加量为300 U/kg时面包比容最大（＜0.05），为（4.86±0.11）mL/g，而未添加酶的对照组为（4.06±0.417）mL/g，提高了19.7%。本研究结果与Driss等报道相似，其发现来源于Pol6的木聚糖酶Xyn2能够面包比容提高34.9%。木聚糖酶能将面粉中不溶性木聚糖降解为可溶性低聚木糖，促进面筋网络结构充分快速扩展和形成，增加面团吸水和持气能力，增大面包比容。当Xyn22添加量超过300 U/kg时，面包的比容开始降低（图7），可能是由于添加酶量的进一步增加，降低了面团的持水能力，进而影响松弛性和黏性，导致面包比容减小。

图7 ScXyn22对全麦面包比容的影响Fig. 7 Effect of ScXyn22 on specific volume of whole grain bread

2.7 ScXyn22对全麦面包质构特性的影响

由表2可知，添加Xyn22后全麦面包硬度显著降低（＜0.05），且随着添加量的增加先降低后升高，当添加量为150 U/kg时，全麦面包硬度最低，相对于未加酶样品组降低了57.3%。添加Xyn22后全麦面包的咀嚼性也显著降低（＜0.05），添加量为150 U/kg时咀嚼性最低，随着添加量的增加呈先降低后升高趋势（表2）。与本研究结果相似，Driss等报道Pol6来源的木聚糖酶Xyn2能够使面包硬度降低43.5%，Jiang Zhengqiang等报道来源的木聚糖酶Xyn B能够使面包硬度降低57.9%。孟祥平等报道添加木聚糖酶Xyl至米糠的面包（米糠添加质量分数为15%）后，硬度和咀嚼性随着添加量的增加先降低后升高，当Xyl（最适温度35～50 ℃，酶活力5 000 U/g）添加量为60 mg/kg时，面包硬度和咀嚼性最低。该结果可能因为添加的木聚糖酶后低聚木糖含量增加，面筋能够更好地进行水合作用形成柔软有弹性的网络结构，使硬度和咀嚼性降低；而随着添加量的增加，水解释放大量自由水，使得烘烤过程水分散失过多，进而导致面包的硬度、咀嚼性增加。

添加Xyn22后，全麦面包的弹性、内聚性和回复性都出现显著改变（＜0.05），但不同添加量样品组的这些指标差异不明显（表2）。已有相似研究报道，如孟祥平等报道添加木聚糖酶Xyl后，面包的弹性、内聚性和回复性都显著增加，不同添加量之间相比较并没有明显差异。曾洁等研究发现木聚糖酶对馒头的回复性、弹性和黏性影响不显著。添加木聚糖酶后的面包还原糖含量增加，增加全麦面包的柔软度。

表2 ScXyn22对全麦面包质构特性的影响Table 2 Effect of ScXyn22 on texture properties of whole grain bread

3 结 论

进行了裂褶菌来源GH11家族木聚糖酶Xyn22在毕赤酵母的异源表达、酶学性质测定及其对全麦面包品质影响分析。Xyn22属于中温内切型酸性木聚糖酶。高NaCl浓度能够提高Xyn22的催化活性，该酶属于GH11家族嗜盐/耐盐木聚糖酶；当催化水解桦木木聚糖、小麦阿拉伯木聚糖、-燕麦葡聚糖3 种底物时，相同的NaCl浓度对Xyn22催化活性的影响存在较大差异。Xyn22具有较好的胰蛋白抗性。Xyn22能够提高全麦面包比容，降低麦面面包硬度。全麦面包硬度随着添加量的增加先降低后升高，但不同Xyn22添加量全麦面包的咀嚼性没有明显差异。结果显示Xyn22在全麦食品生产中具有应用潜力。