基于铜纳米簇模拟酶活性建立比色法测定 鱼肉中的次黄嘌呤

赵子轩，杨 雪，魏 洁，陈晓梅

（集美大学海洋食品与生物工程学院，福建 厦门 361021）

新鲜度对水产品的品质及原料的加工适性有重要影响[1]。随着生活水平的提高，人们对于水产品的鲜度要求也越来越高。目前，水产品新鲜度评价方法主要包括常规的感官评价法以及特殊标志物测定法[2]。前者操作繁琐、费时且重复性差，相较而言，特殊标志物测定法准确性好、灵敏度高，因此受到研究者的广泛关注[3]。

次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx）作为一种重要的生物碱，是三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的主要分解代谢产物[4]。水产品死亡后，体内的ATP在酶的作用下发生一系列降解反应，产生Hx，其主要步骤如下：三磷酸腺苷→二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）→ 单磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）→ 肌苷酸（inosinemonphosphate，IMP）→次黄嘌呤核苷（hypoxanthine ribonucleoside，HxR）→Hx[5-6]。相比水产品鲜度的其他特征标志物，Hx在水产品变质的早期即产生[7]。因此，对Hx含量的准确、快速测定有助于评估水产品的早期新鲜度，这对于保障水产品的食用安全性具有重要意义。

目前，Hx的传统检测方法主要有高效液相色谱法[8]、 毛细管电泳法[9]、酶电极传感器法[10-12]等。这些方法需要相对昂贵的设备和熟练的技术人员，不适合应用于Hx的现场快速检测[3]。比色分析法是一种根据待测物质颜色变化而建立起来的定量分析方法，具有操作简便、快速、成本低的优点[13]，在食品和环境污染物检测方面备受关注[14-15]。Tang Yue等[16]合成了具有H2O2模拟酶活性的二维分层状二硫化钨纳米片，当体系中含有Pb（II）时，H2O2模拟酶活性受到抑制，使3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）蓝色氧化物生成量减少，导致650 nm波长处吸光度下降，从而实现对Pb（II）的灵敏检测。Salem等[17]合成了对氨基苯甲酸稳定的银纳米棒，与SO42－结合后银纳米棒发生聚集，反应体系颜色由红色变为蓝黑色，实现对水样中SO42－的检测。课题组在前期研究工作中，合成了具有模拟酶活性的铂钯纳米花修饰石墨烯复合材料，结合TMB实现了对H2O2的比色检测[18]。本实验在前期研究工作的基础上，通过室温搅拌法合成半胱氨酸（cysteine，Cys）稳定的铜纳米簇（copper nanoclusters，CuNCs），以TMB为显色剂，H2O2为底物，考察Cys-CuNCs的H2O2模拟酶活性，结合Hx在黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）的作用下生成H2O2的特点，建立快速、灵敏检测Hx的比色分析方法，并将其应用于草鱼鱼肉鲜度的评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草鱼 厦门集美农贸市场。

Hx（纯度99%）、L-Cys（纯度99%）、TMB（纯度98%） 上海麦克林生化有限公司；黄嘌呤氧化酶 美国Sigma-Aldrich公司；二水合氯化铜（分析纯） 西陇化工股份有限公司；实验用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

F30透射电子显微镜 美国FEI公司；Lambda 265紫外-可见分光光度计、LS55荧光分光光谱仪 铂金埃尔默股份有限公司；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）仪 美国 赛默飞世尔科技公司；ME204分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；TG16-WS台式高速离心机 昆山禾创超声仪器有限公司；RH D S25加热磁力搅拌器 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 Cys-CuNCs的制备

参考文献[19]的制备方法。首先，在剧烈搅拌下向10 mL 5 mmol/L CuCl2溶液中逐滴加入10 mL 5 mmol/L Cys溶液，此时，溶液由淡蓝色变为紫色。在室温下继续搅拌15 min，利用1 mol/L NaOH溶液调节溶液pH 12，此时，溶液变为灰黑色。继续搅拌2 h后，溶液呈青绿色。将所得溶液在9 000 r/min离心15 min，收集上清液重复离心3 次，用截留分子质量为3 500 Da的透析袋避光透析24 h，得到Cys-CuNCs，于4 ℃冰箱密封保存。

1.3.2 Cys-CuNCs模拟酶活性的测试

以TMB为显色剂，H2O2为底物，测试Cys-CuNCs的过氧化物模拟酶活性。实验步骤如下：将10 μL 1.0 mg/mL 的Cys-CuNCs加入2 mL含有1 mmol/L TMB溶液和0.1 mol/L NaAc缓冲液（pH 4.4）的混合溶液中，再加入50 μL的0.1 mol/L H2O2溶液。混合均匀后，室温下静置10 min，检测在652 nm波长处的吸光度。

使用分光光度计在扫描动力学模式下记录652 nm波长处的吸光度变化，研究过氧化物模拟酶的催化氧化反应动力学。实验分别通过固定TMB浓度测试不同浓度H2O2反应速率、固定H2O2浓度测试不同浓度TMB反应速率，在此基础上，计算得到底物的米氏常数Km和最大反应速率Vmax。动力学计算公式为米氏方程：

式中：V为初始速率/（mol/（L•s））；Vmax为最大反应速率/（mol/（L•s））；[S]为底物浓度/（mol/L）；Km为米氏常数/（mol/L）。

1.3.3 Hx的测定

采用比色法进行测定。过程如下：1）将50 μL 1 U/mL XOD加入2 mL含不同浓度Hx的磷酸盐缓冲液中（pH 7.5，0.1 mol/L），30 ℃水浴反应1 h；2）取0.2 mL水浴反应产物加入Cys-CuNCs模拟酶反应体系（同 1.3.2节）中；3）将混合溶液在室温中反应10 min，测定混合溶液在652 nm波长处的吸光度。每组实验重复检测3 次，吸光度取平均值。

1.3.4 鱼肉样品的检测

将新鲜草鱼剔除鱼头、鱼鳞、鱼皮及内脏部分，在25 ℃保存，每隔5 h沿背脊取肌肉部分在4 ℃均质混匀。取均质后的样品5 g加入20 mL 10%高氯酸溶液中，涡旋振荡1 min后，在4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液。用1 mol/L NaOH溶液调节溶液pH值至6.0。随后按照1.3.3节进行Hx浓度的测定，每组做3 个平行样品，结果取平均值。同时取均质后的样品20 g按照GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》[20]中微量扩散法测定样品的挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量，每组做3 个平行样品，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 Cys-CuNCs的表征

图1A为Cys-CuNCs、Cys和CuCl2的紫外-可见吸收光谱图，相比Cys和CuCl2的谱图，Cys-CuNCs在波长300～400 nm之间出现一个宽吸收峰，而在波长500～600 nm之间没有明显的吸收峰。这表明合成的是粒径较小的CuNCs[21]。从图1B可以看出，当激发波长为370 nm时，在495 nm波长处出现Cys-CuNCs的荧光发射峰。插图为Cys-CuNCs在日光和紫外灯下的照片，日光下Cys-CuNCs呈现淡蓝绿色，紫外灯下发出明显的蓝色荧光。这与Cys-CuNCs的荧光发射波长相对应，说明Cys-CuNCs成功合成。

图1 Cys-CuNCs、Cys和CuCl2的紫外-可见吸收光谱（A）及 Cys-CuNCs的荧光光谱图（B） Fig. 1 UV-vis absorption spectra of Cys-CuNCs, Cys and CuCl2 (A) and fluorescence spectrum of Cys-CuNCs (B)

从图2A可见，Cys-CuNCs外观呈圆粒状，具有良好的分散性，颗粒大小均匀。进一步统计分析，得到粒径分布图，如图2B所示，粒径集中分布在2～3 nm之间，平均粒径为2.58 nm。

图2 Cys-CuNCs的电子显微镜图（A）及粒径分布图（B）Fig. 2 TEM image (A) and particle size distribution (B) of Cys-CuNCs

图3A为Cys-CuNCs和Cys的FTIR谱图。Cys谱图中的特征峰可标记为在1 598.80 cm－1处的（COO—）不对称拉伸，3 193.63 cm－1处的（—OH）宽吸收峰以及在2 546.55 cm－1处（—SH）的弱峰。Cys-CuNCs的FTIR光谱与Cys大致相似，但未观察到—SH的吸收峰，证实了S-Cu的相互作用[22-23]。此外，由于高电子致密金属铜和Cys结合导致其偶极矩发生变化，Cys-CuNCs光谱中其他基团的特征振动吸收频率相对于Cys略有不同。实验通过X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）技术研究Cys-CuNCs表面的化合价态， 从图3B可知，Cu在932.2 eV和952.5 eV处各有一个峰，而在942 eV处未观测到明显的峰，表明Cu表面主要为 Cu（I）和Cu（0）[24]。

图3 Cys-CuNCs和Cys的FTIR谱图（A）及Cys-CuNCs中 Cu 2p的XPS图（B）Fig. 3 FTIR spectra of Cys-CuNCs and Cys (A) and XPS energy spectrum of Cu 2p of Cys-CuNCs (B)

2.2 Cys-CuNCs过氧化物拟酶活性分析

为研究Cys-CuNCs的过氧化物模拟酶活性，实验以H2O2为底物，TMB为显色剂，考察模拟酶体系的紫外-可见吸收光谱。如图4A所示，当体系同时含有H2O2、TMB、Cys-CuNCs时，在0～10 min内，反应体系在652 nm波长处的吸光度逐渐增强，插图中反应体系的颜色相应地由无色变为蓝色。实验对不同体系在652 nm波长处吸光度-时间曲线进行研究，如图4B所示，当体系中只含H2O2、TMB时或只含Cys-CuNCs、TMB时，652 nm波长处的吸光度在10 min内没有明显变化，只有同时存在H2O2、TMB、Cys-CuNCs时，652 nm波长处的吸光度增长明显，表明Cys-CuNCs有明显的过氧化物模拟酶活性。

图4 H2O2＋TMB＋Cys-CuNCs体系的紫外-可见吸收光谱（A）及 不同反应体系在652 nm波长处的吸光度-时间曲线（B）Fig. 4 UV-vis spectra of H2O2 + TMB + Cys-CuNCs (A) and absorbance-time curves of different reaction systems at 652 nm (B)

2.3 拟酶动力学分析

为确定拟酶的动力学参数，实验分别改变TMB和H2O2的浓度，在最适条件下测定反应体系在652 nm波长处的吸光度，运用米氏方程获得最大反应速率Vmax和米氏常数Km。为得到更好的实验条件，首先对缓冲液体系及其pH值进行优化，经过实验得知，采用NaAc缓冲体系，pH 4.4时，Cys-CuNCs对H2O2、TMB混合溶液有最大的吸光度，因此确定缓冲体系的最佳条件。动力学分析实验结果表明，固定H2O2浓度调节TMB浓度，当TMB浓度为1 mmol/L时，初速率达到最大值；固定TMB浓度调节H2O2浓度，当H2O2浓度为12.5 mmol/L 时，初速率达到最大值。从表1可知，以TMB和H2O2为反应底物时，Cys-CuNCs的Km值分别为 0.41 mmol/L和2.85 mmol/L，均比辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的Km值低，说明Cys-CuNCs对TMB和H2O2的亲和力均优于HRP，可以实现对H2O2的灵敏检测。

表1 Cys-CuNCs和HRP的酶动力学参数比较Table 1 Comparison of enzyme kinetic parameters between Cys-CuNCs and HRP

2.4 利用Cys-CuNCs检测H2O2结果

由于制备的Cys-CuNCs具有良好的过氧化物模拟酶活性，利用Cys-CuNCs催化H2O2氧化TMB使溶液变蓝的方法检测H2O2。如图5A所示，随着H2O2浓度不断增加，652 nm波长处的吸光度也逐渐增加。以H2O2浓度和652 nm波长处的吸光度建立线性关系，如图5B所示，在5～100 μmol/L范围内H2O2浓度与吸光度呈良好的线性关系，线性回归方程为y=0.001 4x+0.032 7（y为652 nm波长处的吸光度，x为H2O2浓度（μmol/L）），R2为0.994 6，检出限为0.8 μmol/L。结果表明，基于Cys-CuNCs模拟酶活性，可实现对H2O2的灵敏检测。

图5 加入不同浓度H2O2后H2O2＋TMB＋Cys-CuNCs体系的紫外-可见吸收光谱（A）和H2O2浓度对吸光度的影响（B）Fig. 5 UV-Vis spectra of H2O2 + TMB + Cys-CuNCs system added with different concentrations of H2O2 (A) and effect of different H2O2 concentrations on absorbance (B)

2.5 利用Cys-CuNCs检测Hx

根据文献报道[25]，在XOD的催化下，Hx与溶解氧反应生成H2O2。方程式如下：

为得到更好的检测效果，对上述反应的孵育温度和孵育时间进行优化。单因素试验结果表明，当孵育温度30 ℃、反应时间1 h时，反应体系有最大的吸光度，因此在后续实验中选择30 ℃和1 h作为反应体系的孵育温度和孵育时间。XOD催化下产生的H2O2与Hx的量直接相关，Cys-CuNCs可催化H2O2，使其与TMB反应，溶液变蓝色，反应体系在652 nm波长处的吸光度增加。依据上述原理，可实现对Hx的比色检测。以Hx浓度和652 nm波长处的吸光度建立线性关系，Hx浓度与652 nm波长处的吸光度在4～100 μmol/L范围内呈现良好的线性关系，线性方程为y=0.001 8x+0.022 1，R2=0.992 0（y为652 nm波长处吸光度，x为Hx浓度（μmol/L）），检出限为1.2 μmol/L。 图6为不同浓度Hx对反应体系颜色的影响，随着Hx浓度升高，反应体系的颜色从无色透明逐渐变为蓝色，从而实现对Hx的比色测定。

图6 Hx系列浓度反应体系的颜色 Fig. 6 Color of reaction system with the different Hx concentrations

2.6 Cys-CuNCs的选择性

为研究鱼肉中可能存在的干扰物对传感器性能的影响，实验分别以葡萄糖、乳酸、抗坏血酸、尿酸为干扰物，在相同条件下测试这些物质在652 nm波长处吸光度的变化。如图7所示，添加等量物质（100 μmol/L）后，Hx在652 nm波长处的吸光度有显著变化，而添加其他物质后，吸光度变化不明显（A其他＜0.15AHx），表明所建立方法对Hx检测有较好的选择性和抗干扰能力。

图7 不同干扰物对体系吸光度的影响Fig. 7 Effects of different interferents on the absorbance of the system

2.7 实际样品的检测

每隔5 h对25 ℃贮藏的草鱼肉按照2.5节进行处理，之后进行Hx和TVB-N含量的测定，结果如图8所示。草鱼鱼肉随着时间变化，Hx和TVB-N含量变化趋势基本一致，将Hx含量与TVB-N含量建立相关性，可实现对鱼肉新鲜度的评价。在贮藏期0～20 h时，Hx和TVB-N含量增长较为平缓，此时鱼肉品质较为新鲜。在贮藏20 h后，Hx和TVB-N含量变化较为明显，在此之后鱼肉的变质速率明显加快。在30 h时，鱼肉的TVB-N含量超过国标规定的限定值（20 mg/100 g）[26]，此时鱼肉已不再新鲜，所对应的Hx含量为（1.09±0.02）mg/5 g。 因此，可以认为当鱼肉中Hx含量超过（1.09± 0.02）mg/5 g时鱼不再新鲜。

图8 草鱼死后25 ℃贮藏过程中Hx和TVB-N含量变化的关系图Fig. 8 Relationship between the changes of hypoxanthine and TVB-N contents in grass carp muscle during postmortem storage at 25 ℃

3 结 论

本研究通过室温搅拌法得到Cys稳定的Cys-CuNCs，并对Cys-CuNCs的形貌、元素组成、表面官能团和发光特征进行表征。通过分析反应体系的紫外-可见吸收光谱，验证了Cys-CuNCs具有良好的过氧化物模拟酶活性，在此基础上，实现对H2O2的灵敏检测。结合XOD催化Hx生成H2O2的反应，建立了一种检测Hx的比色分析方法。Hx浓度在4～100 μmol/L内与吸光度呈良好的线性关系，检出限为1.2 μmol/L。将该方法应用于草鱼鱼肉中Hx含量的测定，同时根据鱼肉中的TVB-N含量，建立Hx和新鲜度的相关性，实现对鱼肉新鲜度的判断。该检测方法简便快捷、灵敏可靠，研究结果将为其他肉类新鲜度检测方法的改良积累基础资料。