高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术非靶向快速筛查荔枝花、蜂巢和蜂蜜中农药

王思威，孙海滨，刘艳萍，曾广丰，王潇楠，常 虹，曾鑫年

（1.华南农业大学 广东省昆虫行为调控工程技术研究中心，广东 广州 510642；2.广东省农业科学院植物保护研究所， 广东省植物保护新技术重点实验室，广东 广州 510640；3.广东检验检疫技术中心，广东 广州 510623）

荔枝原产于中国，是我国热区的第一大水果[1-2]，是最具岭南特色的名优果品，中国是世界上荔枝产量最大和栽培面积最广的国家[3-5]，荔枝是我国华南地区重要的蜜源性经济作物。岭南高温高湿的气候环境特征导致荔枝上病虫害频发[6]，尤其在荔枝花期和果期，病虫害发生可导致荔枝的成花率低、坐果率下降，从而影响荔枝的产量和质量[7]。目前化学防治仍为主要技术措施。荔枝上主要病虫害有蒂蛀虫、椿象、霜疫霉病、炭疽病等，主要防控药剂为菊酯类、苯甲酰脲类、有机磷类、甲氧基丙烯酸酯类、三唑类等化学农药[8-13]。荔枝需要借助蜜蜂等昆虫媒介完成授粉，蜜蜂在授粉过程中也将蜜汁和花粉带回蜂巢，受农药的内吸传导特性和漂移作用影响，荔枝花中的蜜汁和花粉会含有部分农药，通过蜜蜂转运作用，蜂巢和蜂蜜中也会存在农药残留[14-15]。因此，本研究以荔枝花、蜂巢和蜂蜜为筛查对象，快速分析其中的农药残留水平，为后续评估农药对蜜蜂的暴露风险等研究内容提供基础。

目前，有关蜂蜜中农药的检测方法一般为气相色谱（gas chromatography，GC）法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）联用法、高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法[16-25]，其中GC法和HPLC法的定性能力较弱，且GC、HPLC、GC-MS、HPLC-MS/MS法的定性分析必须有标准物质进行比对。四极杆飞行时间质谱（quadrupoletime of flight mass spectrometry，Q-TOF-MS）具有数据采集速度快、分辨能力高、质量精度高、检测灵敏度高等多重优点，可依据化合物的质量数、保留时间、同位素强度、二级碎片等质谱信息匹配数据库，从而实现在无标准品比对的条件下对目标化合物进行定性，该技术在农产品、畜产品等领域中有害物质筛查方面得到广泛 应用[26-30]。目前鲜见以荔枝花、蜂巢和荔枝蜜为基质的农药筛查分析报道。

本实验以荔枝花、蜂巢和蜂蜜为研究对象，采用改进的QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）前处理方法结合HPLC-Q-TOF-MS技术快速筛查多种农药。该法分析速度快、精准可靠，旨在为全面快速分析荔枝花、蜂巢和蜂蜜中的农药多残留提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈（色谱纯） 美国Fisher公司；甲酸（色谱纯） 美国Fluka公司；十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）、N-丙基乙二胺吸附剂（primary secondary amine，PSA） 上海安谱实验科技股份有限公司。

农药标准物质（纯度≥95%） 德国Dr. Ehrenstorfer公司。准确称取适量标准品，用乙腈稀释成1 000 mg/L的标准储备液；分别准确吸取1 mL各标准储备液，用含0.1%甲酸的乙腈溶液定容至10 mL，配制100 mg/L混合标准溶液，于4 ℃避光保存。

1.2 仪器与设备

20AD高效液相色谱仪 日本岛津公司；TripleTOF™ 5600+高分辨质谱仪 美国AB SCIEX 公司；Milii-Q超纯水机 美国Millipore公司；GTR22-1离心机 北京时代北利离心机有限公司；OA-SYS 氮吹仪 美国Organomation Associates公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

称取荔枝花或蜂巢样品5.0 g，荔枝蜜样品10 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加入10 mL超纯水浸润荔枝花和蜂巢样品，涡旋使蜂蜜样品成均质溶液，在45 ℃水浴中放置30 min，再加入20 mL乙腈进行提取，然后加入5 g氯化钠和2 g无水硫酸镁，立即剧烈振荡，涡旋1 min，以5 000 r/min离心5 min。取10 mL乙腈层溶液，氮气吹至约50 μL，乙腈定容至2 mL，转移至加有0.15 g无水硫酸镁、0.025 g PSA和0.025 g C18的离心管中，剧烈振荡，涡旋10 s，再以10 000 r/min离心2 min。取上清液，过0.22 μm有机滤膜，待HPLC-Q-TOF-MS测定。

1.3.2 检测条件

1.3.2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Xbridge BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 µm）；柱温30 ℃；梯度洗脱：流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件见表1；进样量5 μL；流速0.5 mL/min。

表1 色谱梯度洗脱程序Table 1 Chromatographic gradient elution procedures

1.3.2.2 质谱条件

离子源：大气压电喷雾电离源和大气压化学电离源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）复合源；APCI源：连接AB SCIEX公司自动校正系统，每5 个样品自动校正1 次，以保证系统精确质量数的稳定性。校正液流速0.5 mL/min；一级TOF-MS扫描准确质量范围100～1 000 Da；数据采集时间100 ms；二级IDA-MS扫描准确质量范围50～1 000 Da；高灵敏模式；数据采集时间50 ms；信号阈值100 cps。IDA实验每循环采集6 次数据，动态背景减法扣除。离子源内参数见表2。

表2 TOF-IDA-MS模式质谱参数Table 2 Spectrometric parameters under the TOF-IDA-MS mode

1.3.3 筛查与鉴定方法

高分辨质谱数据在AB SCIEX公司的Analyst TF 1.6软件采集，采用PeakView 2.0、MasterView 2.0软件对实际样品中的农药残留进行筛查。结合荔枝上登记的农药种类、荔枝产地实际样品调研及测定结果、荔枝上的相关技术规程，导入45 种农药的名称和分子式，建立高分辨质谱筛查XIClist列表，该列表的建立是筛查分析的重要依据，直接影响结果的准确性。筛查列表保留时间限定范围为±0.2 min，精确质量偏差为±1×10－5，离子化模式设定为+H模式。软件会计算化合物的实测值与理论值的偏差，通过分子离子的精确质量偏差、同位素分布、同位素比例和保留时间等的计算，给出相应的检索匹配得分值，对于检索结果得分值不小于80的化合物，本方法确认其为检出农药。根据上述筛选出的化合物，对其标准品进行仪器分析，进一步验证筛查结果的准确性，利用基质匹配标准溶液进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化及评价

荔枝花、蜂巢和蜂蜜中含有大量糖类、色素、黄酮类物质，属于较复杂基质，样品如果不经净化直接进样，容易对目标物的定性定量分析产生干扰，影响确证的准确性，同时会对色谱柱、质谱系统等造成严重污染，导致仪器日常维护的人力和财力成本增加。因此对荔枝花、蜂巢和蜂蜜样品的净化十分必要。

蜂巢和蜂蜜样品中含有大量糖分，通过在45 ℃水浴中放置30 min，可使样品中的糖类充分溶解出来，避免凝固，影响后续净化过程；水浴温度过高可导致未知农药的分解现象发生，影响定性定量结果。目前水果、蔬菜等中的有害化学物质的限量水平越来越低，因此需要更为有效和更加灵敏的分析方法检测复杂基质中的有害物质含量，QuEChERS法具有操作简便快速、分析物回收率稳定的独特优势，使其广泛应用于果蔬等多种基质中的农残检测。

提取溶剂选择乙腈，是因其具有极性强、提取范围广、提取农药种类多以及提取样品色素杂质少等特点，是农药残留检测中常用的提取溶剂。荔枝花和蜂巢样品中含有大量蜂蜡、树脂、色素等成分，蜂蜜样品中含有糖类物质，PSA属弱阴离子交换填料，可有效去除样品中的色素和糖类等物质；C18吸附剂具有较大的比表面积，对脂肪、脂类等非极性干扰物具有较强的吸附能力，去除效果显著；无水硫酸镁主要用于去除样品中的多余水分，增加目标农药在有机溶剂中的溶解度。通过PSA+C18联合应用能够明显去除脂类和糖类物质的干扰，使目标物的添加回收率满足分析要求。

2.2 定性分析

自建高分辨数据库是实现非靶向筛查的基础，将待筛查领域项目中所涉及的所有化合物分子式导入MasterView 2.0构成筛查数据库。本研究一级质谱和二级质谱兼顾高分辨率和高灵敏度平衡模式，得到的谱图既有母离子的精确质量数，又自动触发母离子峰高大于5 000 cps的二级质谱全扫描采集，完全满足定性和定量要求。采集的一级质谱图包含化合物的精确质量数和分子式。样品中8 种筛选出农药的一级提取离子流色谱图见图1。使用一级谱图对筛查出的可疑农药根据同位素分布和精确质量数进行匹配分析。如果一级谱图信息匹配成功，再根据二级碎片信息进行匹配。通过ChemDraw Ultra 12.0软件绘制可疑农药的结构式，并将其导入PeakView 2.0软件中，将结构与二级碎片进行匹配，结合相应的检索匹配得分值判断目标化合物是否检出（表3）。

图1 8 种筛选出农药的提取离子流色谱图Fig. 1 Extracted ion chromatograms of eight selected pesticides

表3 8 种筛选出农药的保留时间和质谱信息Table 3 Retention time and mass spectral information of eight pesticides

以嘧菌酯筛查为例，建立非靶向筛查农药的分析方法时，将其分子式输入筛查列表中，并定义离子化模式为[M+H]+，得到的提取离子流色谱图见图2A，可知嘧菌酯的精确质量数误差为0.31 mDa，小于高分辨质谱允许的误差5 mDa。母离子同位素分布见图2B，同位素比值与嘧菌酯理论同位素分布匹配度为98.5%。调用其二级质谱图，结合其结构式进行结构与二级精确质量数的匹配，结果见图2C，嘧菌酯的3 个丰度最大的碎片与结构完全匹配，3 个碎片精确质量数误差小于0.000 1 Da。由此判断样品中的农药为嘧菌酯。为了验证筛查结果的准确性，对嘧菌酯的标准品进行分析，嘧菌酯标准品的保留时间、一级精确质量数、一级同位素分布、二级碎片信息与样品中筛查出的农药完全吻合，证明了该方法的可靠性。

图2 嘧菌酯筛查分析图Fig. 2 Screening and analysis of azoxystrobin

2.3 方法学验证

2.3.1 线性范围和定量限

配制8 种农药在荔枝花、蜂巢和蜂蜜中的基质匹配标准溶液，以峰面积y为纵坐标，对应的质量浓度x（μg/L）为横坐标绘制标准曲线。结果显示，各农药在1～1 000 μg/L范围内均呈良好线性关系，相关系数均大于0.99。以3 倍信噪比确定方法的检出限，以实际添加最低质量浓度确定方法的定量限，8 种农药的检出限为0.03～0.5 μg/kg，定量限为0.4～0.8 μg/kg。

2.3.2 回收率和精密度实验结果

在1、10 μg/kg和100 μg/kg的添加量下8 种农药在荔枝花、蜂巢和蜂蜜中的平均加标回收率分别为80%～95%、81%～95%和81%～96%，相对标准偏差分别为1.2%～5.0%、1.5%～4.1%和1.2%～6.1%，符合残留分析检测要求（表4）。

2.4 实际样品检测结果

对某地区4 个荔枝园内的荔枝花、蜂巢和蜂蜜样品进行筛查和定量分析（表5），结果显示每个果园样品均有农药检出，检出频次较多的农药有苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯和除虫脲。我国暂未规定蜂蜜中上述农药的最大残留限量，欧盟规定蜂蜜中苯醚甲环唑最大残留限量为0.05 mg/kg，除虫脲最大残留限量为0.05 mg/kg，实际荔枝蜜样品检测值均低于欧盟标准。

表5 荔枝花、蜂巢和蜂蜜样品实测结果Table 5 Results of analysis of pesticide residues in litchi flower, hive and honey by HPLC-Q-TOF-MS μg/kg

3 结 论

本实验建立了QuEChERS与HPLC-Q-TOF-MS法快速筛查与确证荔枝花、蜂巢和蜂蜜中的多种农药残留痕量分析方法，该方法在样品基质复杂以及无标准品条件下，可根据一级TOP-MS和二级IDA-MS信息，实现样品中农药的鉴定与分析，方法简便快速、灵敏度高。