发酵时间对半干型发酵牛肉干品质及 蛋白质构象的影响

赵改名，焦阳阳，祝超智,，李佳麒，李珊珊，银 峰，张文华

（1.河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002；2.国家肉牛牦牛产业技术体系中卫站，宁夏 中卫 750000）

牛肉有高蛋白、低脂肪等显著优势，因此近年来牛肉制品受到广大消费者的喜爱[1]。传统牛肉干制品质地较硬，风味单一，不适宜中老年人食用。而半干型牛肉干水分含量高（20%～50%）[2]、嫩度好，可满足大多数消费者的需求。发酵工艺赋予牛肉产品独特的风味并提高其营养价值[3]，同时降低水分含量、水分活度、抑制食品中病原体（如金黄色葡萄球菌等）的滋生，从而提高食品的安全性[4]。因此，可将发酵技术应用于半干型牛肉干的生产，开发出口感好、有安全保障的新产品。发酵肉制品常用的发酵剂主要有酵母菌、霉菌、乳酸菌，其在发酵肉制品中发挥独特的作用，其中乳酸菌至关重要。乳酸菌发酵可产生大量乳酸，研究表明[5-7]，乳酸可通过弱化肌原纤维、结缔组织提高肉的嫩度。

目前，关于发酵牛肉产品的研究主要集中在优势菌种的筛选、发酵剂的研发及相关产品的工艺优化等方面。赵改名等[8]以云南自然发酵火腿为原料，筛选1 株产酸能力、发酵特性及对NaCl、NaNO2的耐受性均较好的乳酸菌，其被鉴定为戊糖片球菌。Arief等[9]发现发酵可降低牛肉香肠的pH值与水分含量，减缓脂质氧化速率，抑制腐败菌的生长，且延长货架期。李艳青等[10]对发酵牛肉香肠的工艺进行优化，得出最佳发酵工艺条件，其中乳酸菌的最适添加量为106CFU/g，最适温度为30 ℃，最适发酵时间为60 h。张金铎等[11]研究发现干酪乳杆菌添加量为107CFU/g时，发酵牛肉串符合各项指标要求。发酵过程中，蛋白质发生不同程度的降解，蛋白质构象也会随之变化[12]。拉曼光谱技术具有快速、无损、样品量少等特点，现已经被运用到检测肉类蛋白结构变化[13]。

本实验将沙克乳杆菌加入牛肉中分别发酵0、12、24、36、48、60 h。通过对水分含量、水分分布、pH值、水分活度、剪切力及感官评价指标的测定及电子鼻的主成分分析（principal component analysis，PCA），对不同发酵时间半干型发酵牛肉干的品质进行比较研究，并采用拉曼光谱技术研究不同发酵时间半干型发酵牛肉干蛋白质构象的变化，以期为发酵牛肉产品的开发与研究提供理依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所需牛肉的大黄瓜条部位购于河南伊赛公司；沙克乳杆菌为传统腊肉中筛选，来自河南农业大学生命科学学院农业农村部农业微生物酶工程重点实验室。

MRS肉汤培养基 北京奥博星生物技术有限责任 公司。

1.2 仪器与设备

BYXX-50型烟熏箱 中国艾博公司；MODEL2000型沃布剪切力仪 美国G-R公司；SMART System 5水分测量系统 美国CEM公司；35172 BRUZ拍打均质机 法国 AES Chemunex公司；HI 99163便携pH计 德国Hanna公司；AL104电子天平梅特勒 托利多仪器（上海） 有限公司；GHY-3010超级恒温槽 中国凡帝朗科技公司；PEN3电子鼻 德国Airsense公司；IPC-810B核磁共振成像仪 上海纽迈电子科技有限公司；Raman HR Evolution拉曼光谱仪 法国HORIBA公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备工艺流程

将原料肉除去筋膜脂肪，修整为3 cm×1 cm×1 cm块状。在修整好的牛肉块中加入食盐1.2%、糖1%、葡萄糖1.2%、亚硝酸钠0.01%、D-异抗坏血酸钠0.03%，4 ℃腌制24 h。菌液离心后弃去培养基，取离心管菌体沉淀，接种量为107CFU/g，发酵剂均匀涂抹在样品表面，25 ℃分别发酵0、12、24、36、48、60 h。取发酵后的牛肉，加入等质量的清水卤煮，使用功率3 500 W煮沸后转1 800 W至汤汁收干后即可。将烤盘置于烘箱中，100 ℃烘烤15 min，翻面后70 ℃烘烤35 min，最后取出翻面于70 ℃烘烤20 min。室温保存以待检测。

1.3.2 pH值测定

参考GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》[14]。

1.3.3 剪切力测定

参考Li Miaoyun等[15]的方法并略作修改。使用沃布剪切力仪垂直方向切下样品肌纤维，每组样品重复测 定5 次。

1.3.4 水分含量测定

将样品切为碎末状，置于SMART System 5水分测量系统中测量其水分含量。

1.3.5 水分活度测定

采用水分活度仪进行测定。

1.3.6 水分分布的测定

参考焦阳阳等[16]的方法并略作修改，取2 g样品，包裹保鲜膜后置于圆柱形玻璃试管底部，每个样品重复3 次，使用纽迈核磁共振分析应用软件Ver 4.0软件对横向弛豫时间（T2）进行反演。

1.3.7 电子鼻的测定

参考孟舒雨等[17]的方法对实验样品进行电子鼻测定。

1.3.8 拉曼光谱测定

将样品修整为0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm块状，置于50 倍镜头下，调整好镜头与样品的距离至成像清晰后，对样品开始扫描，固定波长532 nm，功率衰减片为25%，曝光时间15 s，扫描范围为400～2 000 cm－1，每个样品重复3 次。

1.3.9 感官评价

邀请食品专业20 名学生，按表1对加工后半干型发酵牛肉干的组织状态、色泽、风味、咀嚼性共4 组指标进行评价，每个指标最高分均为25 分。

表1 感官评定标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of semi-dried fermented beef jerky

1.4 数据分析

采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析、相关性分析及PCA，数据以±s表示，使用Origin 8.5软件绘图。使用Lab Spec 6软件对拉曼光谱数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 发酵时间对半干型发酵牛肉干pH值、剪切力、水分活度、水分含量的影响

由图1A可知，不同发酵时间的半干型牛肉干pH值差异显著（P＜0.05），发酵后的半干型牛肉干pH值均低于未发酵牛肉干的pH值。发酵过程中产生的乳酸可降低肉制品的pH值[18]。随着发酵时间的延长，pH值逐渐降低，在发酵60 h时pH值降到5以下。pH值降低可有效抑制食品中的病原体，从而延长其货架期[19]，因此产酸能力是筛选乳酸菌的重要指标[10]。剪切力可作为肉制品嫩度的判断依据[20]，剪切力越小，嫩度越大。不同发酵时间的半干型牛肉干剪切力差异显著（P＜0.05），剪切力呈先下降后上升的趋势（图1B），其原因可能为发酵初期pH值下降利于肌原纤维蛋白降解。在一定范围内，pH值越低肌原纤维降解程度越大[21]。卜宁霞[22]研究发现，发酵对组织结构破坏较为严重，肌肉纤维结构疏松，甚至出现孔洞，说明微生物发酵可有效破坏肌纤维结构的结合性。调节pH值引起的蛋白质降解及对结缔组织的软化可改变产品嫩度[23]。但随着发酵时间的延长，水分含量与水分活度过低，导致剪切力上升。由图1C可知，不同发酵时间的半干型牛肉干水分活度存在显著差异（P＜0.05），发酵后半干型牛肉干的水分活度显著低于未发酵牛肉干的水分活度，随着发酵时间的延长水分活度逐渐降低，其原因为牛肉干经乳酸菌发酵后pH值降低，蛋白质持水能力下降，导致水分活度下降[24]。水分活度降低可抑制腐败菌的生长，延长其货架期[25]。由图1D可知，不同发酵时间的半干型牛肉干水分含量也存在显著差异（P＜0.05），发酵后牛肉干的水分含量显著低于未发酵牛肉干的水分含量 （P＜0.05），随着发酵时间的延长，水分含量逐渐降低。水分含量的降低有利于水分活度的降低，二者均对产品风味、色泽等感官性状及产品货架期具有重要意义[26]。

图1 发酵时间对半干型发酵牛肉干pH值（A）、剪切力（B）、 水分活度（C）、水分含量（D）的影响Fig. 1 Effect of fermentation time on pH (A), shear force (B), water activity (C) and moisture content (D) of semi-dried fermented beef jerky

2.2 不同发酵时间半干型牛肉干的水分分布

T2可表达肉制品中结合水、不易流动水、自由水3 种状态水分的分布特征[27]，峰比例的变化可反映样品中3 种状态水分子流动转移的情况[28]。由图2可知，发酵后的半干型发酵牛肉干，结合水的比例显著增加（P＜0.05）后基本保持稳定，不易流动水比例显著低于不发酵的半干型牛肉干（P＜0.05）。这说明发酵使部分不易流动水转化为结合水，其原因可能为半干型发酵牛肉干内部蛋白质变性导致的水分散失及流动性降低。Bertram等[29]研究发现肌动蛋白变性与肉制品脱水有关，肉制品中水分的流动性与部分蛋白质变性有关。众所周知，微生物不能利用结合水，因此结合水的比例越大，食品的保存效果越好[30]。

图2 发酵时间对水分分布的影响Fig. 2 Effect of fermentation time on water distribution

2.3 发酵时间对半干型发酵牛肉干感官品质的影响

由图3可知，不同发酵时间的半干型牛肉干组织状态、色泽、风味、咀嚼性评分及感官总分存在显著差异（P＜0.05），发酵12、24、36 h的半干型牛肉干组织状态评分显著高于空白组，发酵36 h的半干型牛肉干色泽、风味、咀嚼性评分以及感官总分均显著高于其他组。发酵36 h的半干型牛肉干比其他组颜色更红，其原因可能为沙克乳杆菌具有将棕色高铁肌红蛋白转变成亮红色的亚硝基肌红蛋白的能力[31]。Gao Xueqin等[32]发现类似的结果，乳酸菌有能力使肉的颜色从棕色变成鲜红色。感官总分整体呈先上升后下降的趋势，其原因可能为发酵36 h内的沙克乳杆菌生长良好，36 h后菌株进入衰退期，对产品的影响减弱[33]。并且发酵时间超过48 h后产品的酸度过高，不适合大多数消费者的感官需求。结果表明，发酵36 h的产品，感官效果最佳。

图3 发酵时间对半干型发酵牛肉干组织状态（A）、色泽（B）、 风味（C）、咀嚼性（D）、感官总分（E）的影响Fig. 3 Effect of fermentation time on tissue status (A), color (B), flavor (C), chewiness (D) and overall sensory score (E) of semi-dried fermented beef jerky

2.4 半干型发酵牛肉干电子鼻分析

由图4可知，PC1的贡献率为67.5%，PC2的贡献率为15.5%，二者可以代表83.0%的信息，因此其包括了半干型发酵牛肉干气味物质的大部分信息。未发酵牛肉干数据点与其他4 种半干型发酵牛肉干数据点均无重叠，说明发酵牛肉干与未发酵牛肉干的挥发性气味差异性较大。发酵0、12、24 h数据点距离较近，说明这3 个发酵时间半干型牛肉干的整体风味相似。因此发酵产生特殊风味的时间应不低于24 h。由图5可知，电子鼻的10 个传感器对不同发酵时间发酵牛肉干气味均能做出不同程度的响应。电子鼻W1C、W3C、W6S、W1S、W1W分别感应芳烃化合物、胺和部分芳香族化合物、氢化物、烷类化合物、硫化合物。电子鼻W5C感应烯烃、芳族、极性分子。电子鼻W2W感应芳烃化合物、硫的有机化合物。电子鼻W5S、W3S、W2S分别感应氮氧化合物、烷类和酯类、醇类和部分芳香族化合物。样品在W5S、W3S的响应值随着发酵时间延长而增加。W2S发酵后响应值高于未发酵响应值。说明沙克乳杆菌利用牛肉中的脂类等物质产生了酯类、醇类等挥发性化合物，乳酸菌胞内酯酶通过脂肪水解等化学反应改善肉制品风味，赋予半干型发酵牛肉干特殊的风味[34]。

图4 电子鼻检测半干型发酵牛肉干PCAFig. 4 PCA plot for electronic nose data of semi-dried fermented beef jerky

图5 电子鼻检测半干型发酵牛肉干的百分比堆积图分析Fig. 5 Percentages of response signals of 10 electronic nose sensors for semi-dried fermented beef jerky

2.5 发酵时间对半干型发酵牛肉干蛋白质二级结构的影响

使用Lab Spec 6软件对酰胺I带（1 600～1 700 cm－1）进行峰分离和曲线拟合[35]，计算得到蛋白质结构的相对含量，如图6所示，α-螺旋是对照组（0 h）蛋白二级结构最主要的元素，其相对含量最高（67%），其次为无规卷曲（19%）、β-折叠（13%），而β-转角相对含量最低（2%）。发酵后，半干型发酵牛肉干蛋白质二级结构发生了明显变化，随着发酵时间的延长，α-螺旋相对含量呈先下降后上升的趋势，β-折叠相对含量在24 h后整体呈上升趋势，β-转角与无规卷曲相对含量呈先上升后下降的趋势。在0～48 h内半干型发酵牛肉干的部分α-螺旋结构转化为β-折叠、无规卷曲结构，其表明蛋白质结构由规整向松散转化。到60 h，α-螺旋相对含量比48 h略有增加，说明部分α-螺旋结构重新生成。α-螺旋结构相对含量先减小后又增加，说明α-螺旋结构在发酵过程中伸展和重新生成，可能在此时发生了结构重组。pH值、盐渗透等均可能导致发酵过程中蛋白构象发生改变[12]。

图6 半干型发酵牛肉干蛋白质二级结构相对含量Fig. 6 Relative contents of protein secondary structures in semi-dried fermented beef jerky

2.6 发酵时间对半干型发酵牛肉干二硫键的影响

二硫键主要有3 种模式，gauche-gauche-gauche（g-g-g）模式（500～510 cm－1）、gauche-gauche-trans（g-g-t）模式（515～525 cm－1）与trans-gauche-trans（t-g-t）模式（535～545 cm－1）。由图7可知，g-g-g构象与g-g-t构象是半干型发酵牛肉干中二硫键存在的主要形式。发酵0～48 h，随着发酵时间的延长二硫键t-g-t构型相对含量逐渐下降。蛋白质中部分二硫键受到破坏，分子间的作用力降低，蛋白结构的稳定性与功能 下降[36]，其原因可能为发酵降低pH值，导致部分蛋白更容易降解，这与2.1节的结果一致。发酵60 ht-g-t构象略有上升，其原因可能为g-g-g、g-g-t构象的二硫键向t-g-t构象转变。

图7 半干型发酵牛肉干二硫键相对含量Fig. 7 Relative contents of three types of disulfide bonds in semi-dried fermented beef jerky

3 结 论

本研究对沙克乳杆菌发酵半干型牛肉干发酵过程中基本品质进行了评价，结果表明，发酵24 h时，产品嫩度最好，当发酵时间不低于24 h时，产品风味与未发酵产品相比会发生明显变化，说明要使发酵后的产品产生明显发酵风味，发酵时间应不低于24 h。发酵36 h产品适口性较好，总体可接受度显著高于其他组。发酵60 h产品过酸且嫩度较差，不符合大多数消费者的感官倾向。另外，发酵过程中，产品的不易流动水部分转化为结合水，其延长产品的货架期。α-螺旋结构向其他无序结构转化，从而使蛋白质更容易降解，风味更易产生。因此，以产品的感官、pH值和剪切力为主要考察依据时，半干型发酵牛肉干的最适发酵时间应控制在24～48 h之间。