脑卒中后抑郁大鼠海马和丘脑神经生长因子及其高亲和力受体TrkA mRNA和蛋白的表达变化

刘新黎 冯炯 胡浩宇 陈家俊

脑卒中后抑郁（PSD）是脑卒中引起的一种有情感障碍性疾病［1］，是一种心理障碍，临床症状显著，主要为兴趣减退、情绪低落，对患者预后造成严重不良影响［2-6］。同时，在脑卒中复发、神经功能康复的影响因素中，PSD 也是一个独立危险因素。本研究探讨PSD大鼠海马和丘脑神经生长因子（NGF）及其高亲和力受体TrkA mRNA 和蛋白的表达变化。

1 材料与方法

1.1 材料 金华市职业技术学院动物实验中心提供的52 只清洁级健康成年雌性SD 大鼠，体质量200～250 g，符合实验处置动物和实验动物伦理学标准。购自上海信裕生物科技有限公司生产的TrkA 兔抗单克隆抗体（xy11073-MM04）、免疫组织化学实验试剂NGF，上海科顺生物科技有限公司生产的TR-IZOL 试剂盒、RTPCR 试剂盒、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH）引物、神经生长因子（NGF）及其高亲和力受体TrkA。

1.2 动物模型的分组及处理方法 对大鼠进行行为学评分，应用Open-field 法，选择评分相近的大鼠进行随机分组，共4组，分别为PSD组、脑卒中组、抑郁组及对照组，每组各13 只。PSD组：应用线栓法建立局灶性脑缺血大鼠模型，每笼饲养1 只，术后1 周应用孤养法与慢性不可预见的温和应激刺激（CUMS）中7 种刺激方式：①禁食（24 h）、②禁水（24 h）、③夹尾（2 min）、④冷水游泳（4℃，5 min）、⑤潮湿垫料、⑥倾斜鼠笼、⑦束缚（1.5 h）。建立PSD 大鼠模型；脑卒中组：应用线栓法建立局灶性脑缺血大鼠模型，每笼饲养6～7 只；抑郁组：每笼喂养1 只，运用孤养法与慢性不可预见的温和应激刺激（CUMS）建立大鼠抑郁模型；对照组：每笼喂养6～7 只，正常饮食及饮水，与模型组同时进行蔗糖水消耗实验。

1.3 方法（1）组织制备：取材时间设计在造模后4周，向大鼠腹腔注入1 mL/100 mg 3.6%水合氯醛进行麻醉，将8 只大鼠取出，依据大鼠解剖立体定向谱图将100 mg 丘脑底核组织、0.5 cm 海马CA1、CA3 区从冠状面上切取下来。用焦碳酸二乙酯（4℃预冷）处理标本，用水冲洗3 次，将血迹清洗掉，在EP 管中放置，保存在-80℃的冰箱中，或第一时间在RT-PCR检测中应用。将5 只大鼠取出，在免疫组织化学实验中应用，用4%多聚甲醛（有饱和苦味酸）+生理盐水灌洗，起点为左心室，将丘脑底核组织、海马CA1、CA3 区从冠状面上切取下来，在20%蔗糖溶液中放置，浸泡2 d，在4℃冰箱中沉底，用石蜡包埋方法，进行冠状切片，厚度为10 μm。（2）RT-PCR 检测海马和丘脑NGF mRNA 及TrkA mRNA 表达：将内参GADPH、TrkA、NGF mRNA序列从GenBank 里查找出来，引物序列设计过程中采用Primer premier 5.0 软件。用TRIZOL 试剂盒分别提取丘脑和海马的总RNA，采用紫外分光光度仪对其纯度、浓度进行测定。将cDNA 合成，在此过程中严格依据试剂盒说明书。在PCR 扩增反应中直接应用合成的cDNA第一条链，操作过程中严格依据2×PCR Master Mix Kit试剂盒说明书。NGF、TrkA 及GADPH 引物序列与退火温度见表1。采用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR 产物进行检测，并在BIO-GEL 凝胶成像仪紫外模式下对凝胶图片进行拍摄，再采用BIO-GEL 凝胶分析系统对各目的基因条带及吸光度值进行测定。校正数据后将目的基因/GADPH 计算出来，设定为相对表达量。（3）免疫组织化学染色：采用免疫组织化学二部法对各组石蜡切片进行染色，一抗为TrkA、NGF 兔抗单克隆抗体（Swiss EPIT MICS），最佳反应浓度为1 ∶150。将一抗加入脑的切片中，放置在4℃冰箱中过夜，然后将PV-9000 试剂盒中的试剂1 加入，在37℃温箱中进行30 min 的孵育，漂洗后再将PV-9000 试剂盒中的试剂2（羊抗兔）加入，脱水、透明、封固过程中分别将梯度酒精、二甲苯、中性树胶充分利用。阴性对照为磷酸缓冲盐溶液（PBS）将一抗取代。每组共5 只大鼠，从每只大鼠选取5 张不连续切片，每张切片用BA300 数码照相机在Motic 显微镜下进行拍摄，对5 个视野（400×）进行拍照，对丘脑和海马免疫阳性细胞数进行双盲计数。

表1 NGF、TrkA及GADPH引物序列与退火温度

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件，计量资料用（）表示，多组比较用单因素方法分析，组间两两比较用LSD-t 法，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠丘脑和海马NGF、TrkA mRNA 表达比较 PSD组大鼠海马NGF、TrkA mRNA 表达低于对照组（P<0.05），见表2。

表2 4组大鼠的丘脑和海马NGF、TrkA mRNA表达比较（）

表2 4组大鼠的丘脑和海马NGF、TrkA mRNA表达比较（）

注：与对照组比较，*P<0.05

2.2 4组大鼠丘脑和海马NGF、TrkA 免疫阳性细胞数比较 PSD组大鼠海马NGF 阳性细胞数少于对照组（P<0.05）见表3。

表3 4组大鼠的丘脑和海马NGF、TrkA免疫阳性细胞数比较如下［个/视野，（）］

表3 4组大鼠的丘脑和海马NGF、TrkA免疫阳性细胞数比较如下［个/视野，（）］

注：与对照组比较，*P<0.05

3 讨论

脑卒中通常以急性起病，较快出现神经功能缺损，是一种常见的脑血管疾病。脑卒中患者最常出现的临床表现是偏瘫、偏身麻木、偏盲、失语、构音障碍、口角歪斜，甚至昏迷、抽搐等不同程度的神经功能障碍。临床上引起脑卒中的病因根据TOAST分型有5型，其中大动脉粥样硬化型最为常见，其余还包括心源性栓塞型、小动脉闭塞型、其他明确病因型（如血管炎、血管畸形等）、不明原因型。其中最常见的危险因素是高血压；甚至有一部分患者卒中前即患有不同程度的抑郁症，故有研究认为抑郁症是引起脑卒中［7-9］的危险因素。卒中后幸存者中>30%［10］的患者患抑郁症。PSD 不仅会产生情绪低落、主动性差、兴趣丧失和睡眠障碍等降低生活质量的临床表现［11］，且对卒中预后神经功能缺损和认知功能恢复存在负面影响，导致患者生活质量和满意度下降，增加社会功能缺陷和病死率［12］。PSD 既是卒中后的常见并发症，又是影响卒中预后的危险因素，二者互为因果，若未能及时诊疗，可造成恶性循环，给家庭和社会造成沉重负担［13］。

相关医学研究表明［14］，在PSD 大鼠发病过程中，NGF mRNA 表达降低可能发挥重要作用。本实验结果显示，PSD组大鼠海马NGF mRNA 表达低于对照组，PSD组大鼠海马NGF 阳性细胞数少于对照组，表明PSD大鼠海马和丘脑神经生长因子及其高亲和力受体TrkA mRNA 和蛋白表达降低。可能原因是去甲肾上腺素能神经元和5-羟色胺能神经元及其径路在脑卒中后被破坏，造成神经递质低下，进而出现抑郁。PSD 发病机制复杂，涉及神经生物学、神经解剖学、社会心理学、神经内分泌学等诸多因素［15］。神经生物学认为PSD 是一种器质性抑郁，其解剖通路为脑干中存在5-HT 及NE神经元细胞体，神经纤维通过丘脑与基底神经节投射到额叶大脑皮质和海马区域，调控人类情绪和情感［16］。