肝细胞肝癌肿瘤异质性及分子演进机制

陈伟男 李建春 刘阳 张艳明 张海宇

原发性肝癌是起源于肝脏上皮或间叶组织的消化系统常见恶性肿瘤，具有高发病率和病死率［1］。近年来，靶向治疗和免疫治疗等获得突破性进展［2］并成为研究热点［3］。本研究将通过分析现有肝细胞肝癌测序数据，进一步分析该肿瘤异质性，发现其可能存在的不同亚型以及亚型的肿瘤演进机制，为肝细胞肝癌新的诊疗方法和治疗策略的开发提供理论支持。

1 资料与方法

1.1 数据下载及整理 肝细胞肝癌样本来自TCGA 数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/），包含肝细胞肝癌的mRNA 表达数据和拷贝数变异数据。该数据库包含374 例肝细胞肝癌样本mRNA 表达数据和378 例肝细胞肝癌样本拷贝数变异数据。所纳入所有数据均符合TCGA 的出版指南。采用R 软件（v 4.0.0）中DESeq2包对mRNA 表达数据进行归一化分析，基于中位数绝对偏差（MAD）选择前3000 个可变性最高的编码基因纳入后续分析。

1.2 数据分析（1）肝细胞肝癌样本数据聚类分析：采用R 软件中NMF 包对肝细胞肝癌样本进行无监督聚类。使用默认参数的随机选取值，开始循环计算50次，以确定最佳等级参数，然后使用最佳等级参数循环计算300 次以获得最终的NMF 聚类分组方案。随后采用主成分分析（principal component analysis，PCA）降维，提取NMF 分组信息对样本进行标记，评估聚类分组结果的一致性。（2）免疫成分分析：采用R 软件中GSEABase 包，对样本进行肝细胞肝癌mRNA 数据行ssGSEA 分析，分析肿瘤样品的免疫成分，计算每个样本每种免疫细胞的构成。使用R 软件中ESTIMATE 包默认参数从表达矩阵中评估免疫评分和肿瘤纯度。（3）筛选DEG 构建PPI 网络：采用R 软件中的limma 包筛选差异表达基因，通过t检验分析NMF1 和NMF2 两组间的基因表达，以│log FC │≥2 和P<0.01 为筛选标准。使用R 软件中的ggplot2 包绘制差异表达基因火山图。VENN 网站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）绘制维恩图。采用STRING（https：//string-db.org/）平台分析差异基因的蛋白信息。将蛋白互作网络导图cytoscape 软件（v 3.6.1），采用cytoHubba 插件计算差异基因之间连通性权重得分，选定得分最高的基因为核心基因，且采用MOCODE 插件筛选首要模块。（4）生物学功能分析：将差异表达基因上传至DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行生物学功能注释分析。采用GO（gene ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析将差异表达基因富集于基因功能、细胞成分以及生物学过程和信号通路等。（5）拷贝数变异分析：采用GenePattern 平台（https：//cloud.genepattern.org/gp/pages/index.jsf）的GISTIC 分析模块分析肝细胞肝癌样品的拷贝数变异情况。参考基因组设置为人类hg38（human genome38）版本。每个探针标记位点的扩增或缺失G-score 评分情况，反映该位点的变异深度和频率［4］。

1.3 统计学方法 采用R 软件。符合正态分布的计量资料以（）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）；计数资料采用秩和检验。Benjamini-Hochberg 分析用于多次检验后的校正。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞肝癌分子亚型的划分 将肝细胞肝癌患者mRNA 数据通过NMF 聚类分析，可将患者明显分为两个不同亚组NMF1组和NMF2组（见图1A）。随后PCA分析将不同亚组患者样本信息标记着色，观察其在空间分布状态，可见两个亚组有明显分界（见图1B）。

图1 肝细胞肝癌分子亚型划分

2.2 不同亚型免疫成分的分析 与NMF2组比较，NMF1组免疫评分更高而肿瘤纯度更低，CON组免疫评分最高，差异有统计学意义（P<0.05）（见图2A、2C、表1）。在HLA 相关基因及免疫检查点基因（CD274、BTLA、ICOS、IDO1、LAG-3 和TIM-3）的表达水平在三组间也显著不同，CON组表达水平最高，而NMF2组最低，差异有统计学意义（P<0.05）（见图2B、2D，表1）。NMF1组和NMF2组免疫细胞组成也不同，尤其幼稚B 细胞、M0 巨噬细胞、M2 巨噬细胞和单核细胞等（见图2E）。免疫评分及浸润情况与肿瘤纯度为负相关。

图2 A.ssGSEA免疫评分热图；B.HLA相关基因表达水平对比；C.免疫评分及肿瘤纯度对比；D.免疫检查点基因表达量对比；E.免疫细胞浸润对比

表1 免疫相关评分及基因表达

2.3 差异表达基因的筛选以及蛋白网络的构建 本研究分别筛选所有肝细胞肝癌样本、NMF1组样本、NMF2组样本与正常CON组样本间的差异表达基因。并通过VEEN 分析，筛选其共同差异表达基因和特征性差异表达基因（见图3A）。共发现810 个基因始终在肝细胞肝癌样本中差异表达，包括FAM83D、TRIP13、ANLN、GTSE1、CDCA3 等；有768 个基因仅在NMF1组中差异表达，包括SERPINC1、AHSG、APOA1、AFP、IGFBP1 等；有283 个基因仅在NMF2组中差异表达，包括IL6、IL10、CXCL8、CCL2、CXCL1 等（见图3B、表2）。通过STING 数据库构建不同分组差异表达基因的相互作用网络，并根据基因权重筛选出各分组核心基因见图3C。

图3 A.各组差异表达基因火山图；B.VEEN图；C.各组PPI网络，分别为全部样本中810个差异表达基因网络、NMF1中768个特征差异表达基因网络、NMF2中283个特征差异表达基因网络

表2 PPI网络权重前10的基因

2.4 生物学功能注释 对肝细胞肝癌始终差异表达基因、NMF1组特征差异表达基因和NMF2组特征差异表达基因进行GO 和KEGG 生物信息注释分析。结果发现，肝细胞肝癌始终在细胞分裂、有丝分裂核分裂、染色体端粒、细胞周期和P53 信号通路等发生异常改变。NMF1组主要为代谢通路、药物代谢、碳代谢、氨基酸代谢和PPAR 信号通路等发生改变；NMF2组的改变主要在细胞因子受体相互作用、NOD 样受体信号通路、蛋白消化和吸收等（见图4A-C）。NMF1组NMF2组成分改变存在区别，表明两组肿瘤异质性明显。通过不同分组差异表达基因的相互作用网络分析，筛选出其首要模块，并对模块基因行功能通路富集分析，结果显示肝细胞肝癌首要模块基因富集于有丝分裂和分裂、细胞分裂和姐妹染色单体凝聚；NMF1 首要模块基因富集于细胞外空隙、胞外区和外泌体；NMF2 首要模块与信号转导、趋化因子调节信号通路和趋化因子活化相关（见表3）。

图4 A～C.各组差异表达基因GOKEGG富集的生物学功能；D～E.肝细胞肝癌拷贝数变异情况

表3 差异表达基因PPI模块功能通路富集

2.5 拷贝数变异分析 通过GISTIC 分析肝细胞肝癌患者中的拷贝数变异情况。共发现108966 个CNV 缺失和114190 个CNV 扩增，发生拷贝数显著改变的基因有2042 个，其中NMF1组有35 个特征差异表达基因，包 括PEBP4、DIRAS1、KISS1R、LEF1-AS1、RHCE等；NMF2组有20 个特征差异表达基因，包括DUSP5、VWA2、TLX1、ZFPM2-AS1、EFNA5（见 图4D-E、表4）。NMF1组和NMF2组共有的拷贝数变异位点有20p13、5q11.2、17q21.2、1p13.3 和1p36.1 等。NMF1组与NMF2组拷贝数变异位点比较，NMF1组特征性拷贝数变异较明显的位点为4q13.2，NMF2组特征性拷贝数变异较明显的位点为1p31.1、3q29、6p21.32、8p11.22和17p11.2（见图5）。

图5 A～B.NMF1组肝细胞肝癌患者拷贝数变异情况；C～D.NMF2组患者肝细胞肝癌拷贝数变异情况

表4 受拷贝数变异显著影响的DEG

3 讨论

本研究通过分析肝细胞肝癌的mRNA 测序数据探究肝细胞肝癌内部的异质性，并根据对不同分组差异表达基因生物学功能富集分析，探讨肝细胞肝癌分子机制。研究结果表明，肝细胞肝癌始终在细胞分裂、有丝分裂核分裂、染色体端粒、细胞周期和P53 信号通路等显著异常改变。端粒是染色体末端上的DNA 蛋白质复合体，呈现为G-四倍体，在肿瘤的发生中发挥重要作用［5］。细胞由于端粒酶活化而获得无限增殖能力已在包括肝细胞肝癌的多种癌症中被证实，其机制是端粒维持端粒在细胞分裂过程中长度的稳定性实现的［6］。

肝细胞肝癌患者mRNA 数据通过NMF 聚类分析，可分为NMF1 和NMF2 两个亚型，其中NMF1组功能信号通路改变主要为代谢通路、药物代谢、碳代谢、氨基酸代谢和PPAR 信号通路等；NMF2组的功能信号通路改变主要在细胞因子受体相互作用、NOD 样受体信号通路、蛋白消化和吸收等。癌症的演进和代谢关系密切，细胞代谢改变是癌症发生导致的结果也可反作用促进癌症进展［7］。NOD 样受体在固有免疫应答中具有重要意义，尤其在监测细胞内微环境、调节免疫和清除病原体方面［8］。WANG 等发现NOD2 和NLRX1 基因的表达水平与肝细胞肝癌预后显著相关［9］，提示NOD 样受体通路可作为NMF2 型肝细胞肝癌患者预后评价。

本研究通过分析NMF1 和NMF2 型肝细胞肝癌，发现NMF1 型肝细胞肝癌相较于NMF2 型免疫评分更高，免疫浸润水平更高，肿瘤纯度更低。此外，NMF1 型在免疫评分和免疫细胞组成上更接近于正常肝细胞。然而，差异表达分析和拷贝数变异结果表明，NMF2 型肝细胞肝癌差异表达基因少，且倾向更少CNV 发生，基因组更稳定。综上所述，NMF1 型肝细胞肝癌肿瘤纯度低、免疫评分高、免疫浸润水平高且恶性程度低，可能对免疫治疗反应性更好。