HPLC定量检测小麦粉中苯甲羟肟酸

付萌，韩建勋, ，宋薇，富玉，张雅莉，李婷

1.谱尼测试集团北京检验认证科学研究院有限公司（北京 100095）；2.谱尼测试集团股份有限公司（北京 100095）

苯甲羟肟酸[1-2]是一种金属络合试剂和高效的矿物捕获剂，然而一些厂家为进一步增强面粉的筋度、白度、蓬松度等[3]，在小麦粉或面粉改良剂中非法添加苯甲羟肟酸。研究表明苯甲羟肟酸的大鼠口服致死中量（LD50）大于500 mg/kg，且苯甲羟肟酸是比较难降解的有机物[4]，对人类和生态环境存在潜在的风险和危害。原国家食品药品监督管理总局[5]多次发布公告，要求各地严格监控面粉质量安全，其中苯甲羟肟酸为重点关注有毒有害物质之一。

苯甲羟肟酸的检测方法主要有液相色谱法[6]、红外光谱法[7-9]、紫外分光光度法[10-11]等，但相关研究多集中于矿物浮选方面。有研究[12]采用高效液相色谱-质谱技术定量检测面粉改良剂中苯甲羟肟酸的含量，虽然检测灵敏度高，但仪器价格昂贵、普适性较低。高效液相色谱技术已相当成熟，被广泛应用于食品中营养成分、有毒有害物质等[13-24]各方面的定性定量检测，在食品安全监测领域发挥越来越重要作用。为有效检测小麦粉中苯甲羟肟酸含量、避免非法添加威胁人体健康，试验建立一种适用于小麦粉中苯甲羟肟酸的高效液相色谱定量检测方法，并与国家市场监督管理总局发布的BJS 202002《小麦粉及其面粉改良剂中苯甲羟肟酸的测定》补充检验方法进行对比。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

21份小麦粉（市售，样品信息见表1）。

表1 样品信息

苯甲羟肟酸（99.0%，Sigma公司）；苯甲酸（99.5%，Sigma公司）；甲醇（色谱纯，Fisher Scientific公司）；乙腈（色谱纯，Fisher Scientific公司）；磷酸二氢钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸（分析纯，北京化工厂）。

Agilent series 1200高效液相色谱仪（配备二极管阵列检测器，Agilent公司）；超纯水净化仪（Millipore-Q公司）；AB135-S分析天平（感量0.1 mg，METTLER TOLEDO公司）；Vortex-Genie 2涡旋震荡器（Scientific Industries公司）；H1850台式高速离心机（湖南湘义离心机仪器有限公司）；KH-500E超声清洗器（中国昆山禾创超声仪器有限公司）；有机相滤膜（尼龙，0.22 μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；pH精密试纸（pH 0.5～5.0，杭州特种纸业有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

标准储备液：准确称取50.00 mg苯甲羟肟酸标准物质，用25 mL 10%（体积比）甲醇/水溶液溶解后定容至50 mL，配制成质量浓度1000.0 μg/mL的标准储备液，于4 ℃储存。标准工作液：用10%（体积比）甲醇/水溶液将标准储备液逐级稀释配制成质量浓度0.25，0.50，1.00，5.00和10.00 μg/mL的标准溶液。

1.2.2 样品前处理

样品前处理方法参考文献[12,25]，并加以改进。称取2.00 g试样，加入8 mL 60%（体积比）甲醇/水溶液旋涡混匀，超声提取20 min，按4000 r/min离心3 min；取上清液过0.22 μm有机相滤膜，上机检测，每个试验重复3次。

1.2.3 仪器条件

色谱柱：InertSustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；进样体积50.0 μL；柱温30℃；检测波长228 nm；流动相A为甲醇，流动相B为磷酸二氢钾溶液（pH 2.5），梯度洗脱，洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序

1.2.4 苯甲羟肟酸质量分数的计算

式中：X为目标物质量分数，mg/kg；c为根据标准曲线计算出的目标物质量浓度，μg/mL；V为定容体积，mL；m为样品质量，g；1000为换算系数。

1.3 数据处理

每个试验重复3次，采用Excel 2013进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 流动相条件优化结果

试验以甲醇为流动相A，以水、不同pH（pH 2.0，2.5，3.0，4.0和5.0）的磷酸二氢钾溶液分别为流动相B。采用pH精密试纸测定流动相A、B混合前后pH的变化，结果发现不同比例流动相A、B两相混合时，混合溶液的pH几乎不变，因此，可排除流动相A、B两相在混合过程中因pH变化而造成目标色谱峰和杂质色谱峰保留时间的改变。

按照1.2.2小节的方法处理小麦粉样品，取1 mL滤液，与1 mL 200 μg/mL苯甲羟肟酸标准溶液混合，上机检测，由仪器自带数据分析软件计算目标物色谱峰对称性及与杂质峰的分离度。如图1和表3所示，以水为流动相B，苯甲羟肟酸色谱峰与样品中杂质色谱峰存在部分交叉重合，无法达到完全分离效果（图1a）；以磷酸二氢钾溶液为流动相B，pH 2.0时，目标物色谱峰与杂质色谱峰几乎完全重合（图1 b）；pH 2.5～5.0时，随着流动相pH增加，杂质色谱峰保留时间前移，而苯甲羟肟酸色谱峰保留时间变化较小，且其对称性及与杂质色谱峰的分离度降低（图1 c～f）。由此说明，最佳流动相条件是pH 2.5的磷酸二氢钾溶液。

表3 不同流动相对苯甲羟肟酸和杂质分离的影响

图1 小麦粉中苯甲羟肟酸在不同流动相条件下的色谱图

2.2 提取试剂的优化结果

准确称取2.00 g小麦粉样品，添加10.00 μg苯甲羟肟酸，以不同体积比（0∶1，1∶9，1∶4，3∶7，2∶3，1∶1，3∶2，7∶3，4∶1，9∶1和1∶0）甲醇/水混合溶液按照1.2.2的方法进行提取分析，每个处理3个平行。由表4和图2可知，使用不同体积比混合的甲醇/水溶液进行提取时，苯甲羟肟酸回收率不同，差异极显著（p＜0.01）。其中，采用100%甲醇或100%水进行提取时，苯甲羟肟酸回收率均低于其他比例甲醇/水混合溶液的回收率；甲醇/水体积比3∶2时，苯甲羟肟酸回收率最高，与其他比例具有显著性差异。因此，选择体积比3∶2的甲醇/水混合溶液作为最佳提取试剂。

表4 小麦粉中苯甲羟肟酸在不同提取试剂条件下的回收率方差分析表（α=0.01）

图2 小麦粉中苯甲羟肟酸在不同提取试剂条件下的回收率

2.3 苯甲酸干扰排除结果

过氧化苯甲酰[26-27]是一种强氧化剂，常用作面粉处理剂，改善面粉色泽，增加面粉白度，加快面粉后熟，延长保质期，提高出粉率等。过氧化苯甲酰用于面粉漂白后会分解成苯甲酸。为排除苯甲酸对方法检测苯甲羟肟酸的干扰，按照1.2.3小节的条件分别测定10.00 μg/mL苯甲羟肟酸标准溶液和10.00 μg/mL苯甲酸标准溶液，结果如图3所示。在相同色谱条件下，苯甲羟肟酸色谱峰保留时间为16.10 min，苯甲酸色谱峰保留时间为25.30 min，2种物质能完成分开。由此说明，该方法中苯甲羟肟酸的检测不会受苯甲酸干扰。

图3 苯甲羟肟酸标准溶液（a）和苯甲酸标准溶液（b）色谱图

2.4 方法有效性测定结果

2.4.1 方法线性范围、检出限和定量限结果

将0.25，0.50，1.00，5.00和10.00 μg/mL的苯甲羟肟酸系列标准工作液，按照1.2.3小节的条件进行测定，以目标物的峰面积为纵坐标，以相应浓度为横坐标绘制标准曲线，得到线性方程和相关系数。如图4所示，苯甲羟肟酸在0.25～10.00 μg/mL范围内线性关系良好，线性方程为y=148.65x-31.327，R2=0.9995，检出限（LOD）为1.00 mg/kg，定量限（LOQ）为3.00 mg/kg。

图4 苯甲羟肟酸标准曲线

2.4.2 方法精密度结果

以小麦粉阴性样品作为空白基质，将苯甲羟肟酸按质量分数6.00 mg/kg的水平进行加标。按照1.2.3的条件测定，重复测定6次。结果发现，6次检测结果分别为6.04，5.96，6.12，6.12，6.12和5.88 mg/kg，平均值为6.04 mg/kg，SRSD为1.7%（表5），表明该方法的精密度良好。

表5 方法精密度分析结果

2.4.3 加标回收率结果

以小麦粉阴性样品作为空白基质，将苯甲羟肟酸按质量分数3.00，6.00和30.00 mg/kg进行3组水平加标试验，每个水平6个平行，按照1.2.2和1.2.3的方法进行测定分析。由表6可知，小麦粉中加标水平为3.00 mg/kg时，苯甲羟肟酸回收率为91.7%～99.0%，平均回收率为94.7%，SRSD为3.2%；加标水平为6.00 mg/kg时，回收率为90.0%～95.8%，平均回收率为92.8%，SRSD为3.8%；加标水平为30.00 mg/kg时，回收率为90.7%～99.0%，平均回收率为93.3%，SRSD为3.2%。结果说明试验方法具有较高准确度。

表6 苯甲羟肟酸加标回收率和相对标准偏差

因此，以试验方法检测小麦粉中苯甲羟肟酸，在0.25～10.00 μg/mL范围内线性关系良好（R2为0.9995），回收率为90.0%～99.0%，相对标准偏差为3.2%～3.8%，检出限（LOD）为1.00 mg/kg，定量限（LOQ）为3.00 mg/kg。

2.5 实际样品测定

采购21份不同产地的小麦粉样品，其中北京市、山东省、辽宁省各2份，河北省4份，河南省和新疆维吾尔自治区各3份，黑龙江省、江苏省、湖南省、四川省、内蒙古自治区各1份。分别使用试验方法及标准方法进行测定，结果经试验方法测定21份小麦粉样品，所有样品均未检出苯甲羟肟酸；使用标准方法进行测定，苯甲羟肟酸目标色谱峰与杂质峰无法分离。

标准BJS 202002中以甲醇为提取试剂，甲醇/0.01%磷酸为流动相，测定小麦粉及小麦粉处理剂中苯甲羟肟酸含量，检出限为0.1 mg/kg，定量限为0.3 mg/kg。实验室使用标准方法进行测定时发现，100%甲醇的提取效率比甲醇/水（体积比3∶2）的混合溶液提取效率低，且在标准方法的流动相条件下，苯甲羟肟酸目标色谱峰与小麦粉中的杂质色谱峰重合，无法进行苯甲羟肟酸的准确定量。与标准方法相比，试验方法中苯甲羟肟酸含量在0.25～10.00 μg/mL范围内线性关系良好，检出限为1.00 mg/kg，定量限为3.00 mg/kg。虽然试验方法的检出限较标准方法高，但是该方法可有效分离苯甲羟肟酸色谱峰与小麦粉中的杂质峰，避免杂质峰对苯甲羟肟酸定量的干扰，具有良好的精确度和准确度。

此外，郑红等[12]建立液相色谱-质谱法检测面粉改良剂中苯甲羟肟酸含量，该方法在0.005～1.000 μg/mL范围内线性关系良好（r2＞0.999），方法检出限为0.01 mg/kg，定量限为0.05 mg/kg。比较而言，虽然试验方法的检出限较高，但2种方法适用对象不同，试验方法适用于小麦粉中苯甲羟肟酸含量的定量测定，而液相色谱-质谱法针对的是面粉改良剂，2种方法是否通用于小麦粉和面粉改良剂两类样品，还需进一步验证。同时，试验方法采用的液相色谱设备，价格相对便宜，普适性较高。

3 结论

针对小麦粉中可能添加的苯甲羟肟酸有毒有害物质，通过优化色谱条件、提取试剂（甲醇/水）体积比，分析苯甲酸干扰性及方法有效性等，最终建立一种可定量检测小麦粉中苯甲羟肟酸含量的高效液相色谱法。该方法可有效分离苯甲羟肟酸与小麦粉中的杂质，具有良好的精确度和准确度，苯甲羟肟酸在0.25～10.00 μg/mL范围内线性关系良好，检出限为1.00 mg/kg，定量限为3.00 mg/kg。对21份不同产地的小麦粉样品进行检测，结果发现均未检出苯甲羟肟酸成分。该方法前处理简单，可操作性强，灵敏度及回收率较高，可满足苯甲羟肟酸的定性定量检测要求。该方法的建立为中国小麦粉的质量控制和安全监管提供技术支撑。