竹叶抗氧化物-胶原蛋白复合涂膜对鲐鱼的保鲜效果

胡嘉惠，林益航，吴诗寅，魏家正，戴宁，陈静

浙江海洋大学食品与医药学院（舟山 316022）

鲐鱼（Pneumatophorus japonicus），鲈形目，鲭科，鲐属，是中国东海与黄海海域的主要经济鱼类[1-2]。鲐鱼体内酶系发达，蛋白质含量较高，因此它的冷藏保鲜期较短，容易在运输和销售过程中发生腐败变质，产生恶臭味和腐败臭味[3-4]。因此为后续加工的顺利进行，运用各种保鲜手段延长鲐鱼的保鲜期至关重要。鲐鱼的保藏技术主要以物理保鲜法，即低温保鲜为主，但低温条件并不能完全阻止鱼肉的腐败和有害微生物的繁殖。栅栏技术能够通过多重保鲜方法的叠加，实现食品的保鲜和贮藏。因此在低温保鲜的基础上，适量添加具有抗氧化活性的植物保鲜剂，有利于实现低温保鲜、抑菌、抗氧化的协同作用，维持食品的优良品质。

竹叶抗氧化物（AOB）是来自于竹叶中的黄酮类、内酯类和酚酸类化合物，能较好抑制多种食品致病菌[5-6]，可作为天然食品抗氧化剂在水产品、肉制品等食品中使用。研究表明，AOB处理后的冷却羊肉能够延长保鲜时间5～7 d[7]。刘梦等[8]研究发现相较于其他几种天然抗氧化剂，AOB能有效减少150 ℃热加工条件下的熟牛肉制品中的脂肪氧化。官爱艳等[9]研究表明AOB对鲜海鲈鱼鱼肉有保鲜作用，经AOB浸泡处理的海鲈鱼较对照组保鲜时间延长4 d。

将可食性膜包裹在水产品上也能够延长水产品的保鲜期。如将鱼鳞胶原蛋白、马铃薯淀粉和高良姜精油混合制备的可食性膜能抑制罗非鱼鱼肉的油脂氧化和微生物生长，延长鱼肉的保鲜期[10]。赵厚菲[11]制备的基于肉桂醛和溶菌酶的复合涂膜显著抑制美国红鱼在冷藏过程中细菌的生长，延缓TVB-N质量分数、TBA值、K值等指标的增加速度，且将货架期延长5～10 d。

试验利用鱼鳞胶原蛋白与竹叶抗氧化物制备具有一定抗张强度及稳定性的可食性抑菌膜，以新鲜鲐鱼鱼片为原料，探究竹叶抗氧化物/胶原蛋白复合可食性抑菌膜对鱼片的保鲜效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

胶原蛋白粉（武汉佰兴生物科技有限公司）；磷酸盐缓冲溶液（国药集团化学试剂有限公司）；转谷氨酰胺酶（上海瑞永生物科技有限公司）；甘油（Ar，西陇科学股份有限公司）；竹叶抗氧化物（AOB，浙江圣氏生物科技有限公司）；琼脂固体培养基（南通凯恒生物科技发展有限公司）；三氯乙酸（TCA，国药集团化学试剂有限公司）；丙二醛标准溶液（北方伟业计量技术研究院）；氯仿（Ar，国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯。

生鲜青占鱼（舟山市国际水产城）。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（浙江海洋大学食品实验室）。

1.1.2 仪器与设备

数控超声波清洗器（KH-500DE，昆山禾创超声仪器有限公司）；电热鼓风干燥机（DH-9626A，日本东京理化器械公司）；紫外分光光度计（UV-2802s，奥豪斯仪器上海有限公司）；半微量凯氏定氮仪（SKD-2000，上海沛欧分析仪器有限公司）；多头磁力加热搅拌器（HJ-6，国华常州仪器制造有限公司）；电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；数显均浆机（T18，上海书培实验设备有限公司）；恒温培养箱（HPX-9082 MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 竹叶提取物/胶原蛋白复合膜的制备

1.2.1.1 制备工艺流程图

1.2.1.2 复合膜的详细制取步骤

用50 mL、50 ℃的磷酸盐缓冲溶液溶解12 g胶原蛋白粉。调节pH 7.5左右并加入适量甘油，于50 ℃恒温水浴加热，加入0.2%转谷氨酰胺酶（按胶原蛋白质量计）充分搅拌，搅拌后均匀加入竹叶提取物，配成的竹叶提取物质量分数分别为胶原蛋白质量的0，0.1%，0.5%，1.0%，3.0%和5.0%的溶液。处理好后静置20 min，使其充分反应。

用均浆机均质10 min，并用超声消泡10 min，处理后竹叶提取物/胶原蛋白混合液在聚乙烯模具中定量流延，成膜液冷却后将其移入电热鼓风干燥机中干燥，干燥温度50 ℃，干燥时间8 h，干燥完毕后，冷却即可揭膜。

图1 竹叶提取物/胶原蛋白复合膜的制备工艺流程图

1.2.2 鲐鱼的复合涂膜保鲜

将鲐鱼去头、去尾、清除内脏后清洗干净，取鱼刺骨两侧鱼片，每片质量（100±5）g，用去离子水洗净，晾干。将鱼片浸泡于不同浓度梯度的复合溶液，0.5 h后取出。于已灭菌的聚乙烯小袋内密封，置于4℃冰箱保存。以未涂膜的鱼片作为对照组，分别测定0～18 d（每隔3 d测定1次）中各样品的鲜度指标。

1.2.3 鲐鱼的微生物学指标测定

1.2.3.1 菌落总数的测定（TVC）

依据GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》[12]，测定贮藏期0～18 d内鲐鱼的菌落总数。菌落计数以菌落形成单位（CFU）计。

1.2.3.2 抑菌性的测定

竹叶提取物复合膜的抑菌性利用琼脂扩散法进行测定。将膜用剪刀剪成直径大小10 mm的小圆片，将其覆盖在用待测菌菌悬液涂布均匀的琼脂培养基的表面上。倒转培养皿，在37 ℃下培养金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，持续培养24 h。观察竹叶提取物复合膜表面的菌体生长状况，同时记录抑菌圈的直径[13]。

1.2.4 鲐鱼的鲜度指标测定

1.2.4.1 挥发性盐基氮（TVB-N）质量分数的测定

按半微量蒸馏法测定[14]。由盐酸体积的消耗量计算TVB-N质量分数。

1.2.4.2 过氧化值（PV）的测定

依据GB 5009.227—2016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》[15]测定贮藏期内鲐鱼鱼肉的过氧化值（PV）。

1.2.4.3 硫代巴比妥酸值（TBA）的测定

参照GB/T 35252—2017《动植物油脂 2-硫代巴比妥酸值的测定直接法》[16]测定产品中硫代巴比妥酸（TBA）的值。

1.2.4.4 感官评定

由食品与药学院的50名受过专业训练的工作人员和学生组成5组评价小组，每组10人，分别对试验组和对照组的鲐鱼进行感官分析。试验组是用竹叶提取物（从微生物学指标测定中选取的最佳抑菌浓度）处理后的鲐鱼片，对照组是没有用竹叶提取物处理的鲐鱼片，在相同条件下置于常温下24 h所得。评价小组成员分别从色泽、气味、总体可接受度3个指标进行感官评价，按表1的要求进行评分，总分为100分，结果求均值。

表1 鲐鱼感官评定表

1.3 数据处理

试验数据均采用3次平行试验结果的平均值，结果以“平均值±标准偏差”表示，使用Origin 2018软件绘图。

2 结果与讨论

2.1 鲐鱼的微生物学指标结果

2.1.1 竹叶抗氧化物对抑菌膜的抑菌性影响

由图2可知：对照组胶原蛋白膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌无抑菌效果，而加入竹叶抗氧化物的胶原蛋白膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制作用，且浓度越高，复合膜的抑菌作用越显著（p＜0.05）。竹叶抗氧化物浓度增加到0.1%时，膜的抑菌性能开始出现，并呈现缓慢上升趋势，竹叶抗氧化物浓度上升至1.0%时，膜的抑菌性明显增加。竹叶抗氧化物浓度3.0%时，此时与大肠杆菌相比，复合膜的抑菌性对金黄色葡萄球菌的抑制效果更加显著（p＜0.05）[6]。

图2 添加不同浓度竹叶抗氧化物复合膜的抑菌性

2.1.2 鲐鱼鱼片菌落总数变化

菌落总数变化（TVC）可以较直观地反映蛋白质和氨基酸的分解与代谢情况。因此测定菌落总数能够用于判定水产品腐败程度。含有不同浓度（0，0.1%，0.5%，1.0%，3.0%和5.0%）AOB的可食性抑菌膜对冷藏鲐鱼鱼片中的菌落总数变化见图3。

图3 冷藏鲐鱼鱼片的菌落总数变化情况

鱼肉原始菌落数为3.15 lg CFU/g，随着贮藏时间延长，各组样品的TVC均上升。与对照组相比，竹叶抗氧化物复合膜包覆的样品菌落总数增长速度较慢，这是由于胶原蛋白溶液包裹于鱼片表面后形成一层薄膜，阻隔鱼片与外界空气的直接接触，同时，竹叶抗氧化物中的黄酮类物质能通过抑制细菌新陈代谢所需的酶类活性，达到抑菌目的[17]。

试验前3 d，各组样品的TVC增长速度平稳。随后鱼体逐步进入自溶阶段，鱼肉组织完整性被破坏后微生物开始从表面侵入到组织内部，各组样品的菌落总数开始出现不同幅度的增长。Al-Daqal等[18]研究表明，水产品的菌落总数超过6 lg CFU/g即为不可食用状态。试验第6天，空白对照组的菌落总数达6.74 lg CFU/g，试验第9天时，添加0.1%和0.5%竹叶抗氧化物的鱼肉样品的菌落总数大于6 lg CFU/g，超出可食用范围；添加1%和3%竹叶抗氧化物的鱼肉样品在第12天超出可食用范围；添加5%竹叶抗氧化物的鱼肉样品的可食用状态一直保持到第18天，比对照组多保持9～12 d。

在相同贮藏时间下，各试验组的菌落总数显著低于对照组（p＜0.05），在相同贮藏环境下，各试验组的保鲜期较对照组更长，表明竹叶抗氧化物具有较强的抑菌作用，且抑菌效果随着浓度升高而加强，该结论与张晓丽等[19]的研究结果相符合。

2.2 复合膜对鲐鱼化学指标的影响

2.2.1 TVB-N的变化

根据GB 2733—2015《鲜、冻动物性水产品》，总挥发性盐基氮（TVB-N）≤20 mg/100 g的海水鱼没有发生腐败现象。若海水鱼TVB-N≤12 mg/100 g，则可归类为新鲜鱼，若海水鱼的TVB-N＞30 mg/100 g则不可食用。TVB-N可反映鱼体的鲜度和蛋白质质量分数，鱼体腐败变质时，蛋白质会受到内源性酶、内部细菌和环境细菌的影响，分解为低级的胺类物质等，并且产生不愉快的气味。7组鲐鱼在为期18 d的贮藏过程中TVB-N数值的变化可由图4反映。随着时间延长，7组鲐鱼的TVB-N在包裹AOB复合胶原蛋白薄膜组与未包裹AOB复合胶原蛋白薄膜组中均不断增大。对照组在第3天时的TVB-N值达28.19 mg/100 g，说明鲐鱼已腐败变质，不可食用。以添加不同浓度的AOB胶原蛋白薄膜作为变量，就TVB-N值的变化而言，与对照组相比，试验组曲线上升速度显然更低；比较不同AOB浓度下各试验组的变化情况，胶原蛋白薄膜中AOB浓度越高，鲐鱼的TVB-N值增加速度越缓慢。添加5%的AOB时，鲐鱼的TVB-N上升速度最缓慢，而且完全腐败发生在第15天，此时TVB-N值为30.79 mg/100 g。由此可见，AOB添加量5%的复合胶原蛋白膜对鲐鱼的保鲜起到良好作用。

图4 冷藏鲐鱼鱼片的TVB-N在使用添加不同浓度竹叶抗氧化物复合膜下的变化情况

2.2.2 PV和TBA值的变化

2.2.2.1 PV值的变化

在18 d贮藏期内，不同AOB添加量的胶原蛋白复合膜对鲐鱼的过氧化值（PV）的测定数值如图5所示。18 d贮藏过程中，随着时间延长，包裹AOB复合胶原蛋白薄膜组与未包裹AOB复合胶原蛋白薄膜组的鲐鱼的过氧化值不断增大，初期变化平缓，后期增速加快，但包膜组的鲐鱼的过氧化值升高幅度不同：0.1%＞0.5%＞1.0%＞3.0%＞5.0%。对照组在第18天时，其过氧化值为15.12，相比初始值而言增加20倍。同时，AOB浓度连续增大，鲐鱼样本的过氧化值显著性差异（p＜0.05）一并增加，显著性越大则越能说明膜的抗氧化效果与AOB添加量相关，即AOB复合胶原蛋白薄膜对鲐鱼的保鲜效果显著，与甘钊生等[20]研究的复合鱼鳞胶原蛋白膜的保鲜效果相吻合。

图5 冷藏鲐鱼鱼片的PV在使用添加不同浓度竹叶抗氧化物复合膜下的变化情况

2.2.2.2 TBA值的变化

鲐鱼由于含有多不饱和脂肪酸，故在贮藏过程中极易发生脂肪的氧化现象。18 d贮藏期内，不同AOB添加量的胶原蛋白复合膜对鲐鱼的TBA的测定数值如图6所示。18 d贮藏过程中，随着时间延长，包裹AOB复合胶原蛋白薄膜组与未包裹AOB复合胶原蛋白薄膜组的鲐鱼的TBA值不断增大，表示鱼体的氧化过程持续不断地发生，且鱼体的氧化程度不断加重。其中，AOB添加量5%时的TBA值的增长最为缓慢，不包膜的对照组的TBA值增长最迅速，且7组曲线的TBA值增长速率曲线各不相同，说明AOB复合胶原蛋白薄膜在延缓脂肪氧化方面起到一定作用，与庞彩霞[21]研究的AOB有清除自由基能力和良好保鲜效果的结论一致。由图6可以看出：贮藏0，3，6，9，12，15和18 d时，添加5%的AOB复合胶原蛋白薄膜组的TBA值和对照组有显著性差异（p＜0.05），且均显著低于对照组，但均与AOB添加量3%无显著性差异（p＞0.05）。这主要是由于鱼肉体内的酶与环境中的微生物共同作用下，鱼肉脂肪分解加速，氧化程度加剧，使鱼肉变质腐败。而AOB复合胶原蛋白薄膜的良好抑菌保鲜效果抑制这种脂肪腐败作用，以AOB添加量5%时的薄膜抑制脂肪氧化的效果最好。

图6 冷藏鲐鱼鱼片的TBA在使用添加不同浓度竹叶抗氧化物膜下的变化情况

2.2.3 鲐鱼的感官评定结果

感官评价是最直观判断鲐鱼品质的方法，鲐鱼的感官评定结果如图7所示。试验组在色泽、气味和总体可接受度中的评分均高于对照组。第1周内2组评分变化不大，这是由于初始阶段细菌基数小、繁殖慢，对鲐鱼品质影响小，而从第9天开始，差距逐渐显现，试验组变化趋势趋于平缓，较稳定，这是由于竹叶抗氧化物具有抑菌性能，抑制腐败菌大量繁殖，使细菌处在一个较为可控的范围内而对照组普遍前期变化小，后期变化大，这是由于细菌大量繁殖，腐败进程加剧，鲐鱼鲜度急剧下降。从总体可以看出，经竹叶抗氧化物处理后的鲐鱼品质更加稳定，鲜度维持时间更长，说明竹叶抗氧化物胶原蛋白膜具有明显抑菌作用。

图7 竹叶抗氧化物复合膜对冷藏鲐鱼鱼片感官评定的影响

3 结论

在胶原蛋白涂膜中添加竹叶抗氧化物可有效增加涂膜的保鲜性能，以及其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果，竹叶抗氧化物添加量5%时，其对膜的改良效果最佳。保鲜复合涂膜通过包覆在鲐鱼表面可有效延缓其TVC增长，延缓蛋白质降解和鱼体的脂肪氧化，对鱼体中的微生物生长繁殖有抑制作用，延缓鱼体腐败，延长产品保藏时间。试验结果为水产品的保鲜提供一种有效方式。

在国内外，利用抑菌蛋白膜防止水产品腐败的案例不多，既是由于抑菌蛋白膜的成本高，相比于防腐剂制作工艺也更复杂，抑菌效果也不如化学防腐剂，如何研制出一种对人体无害、工艺简单、成本低廉且抑菌效果良好的天然防腐剂成为亟待解决的问题。通过对竹叶抗氧化物抑菌蛋白膜的研究，为抑菌蛋白膜研制提供新思路，有望研制出一种多功能、多领域的抑菌蛋白膜。