鱼源胶原肽特征质量指标检测分析

牛林林，袁丹丹，陈 磊，蔡久庆，刘 娟，张 明，陈 勉，张晓元，张艳艳，刘 飞＊

（1. 山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室 山东省多糖类药物工程实验室 多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室 博士后科研工作站，山东 济南 250101；2. 东阿生力源阿胶股份有限公司 聊城市阿胶多肽提取技术研发重点实验室，山东 聊城 252218）

胶原肽，又称胶原水解物，是由胶原蛋白衍生的短链氨基酸，由胶原蛋白经过热处理、酸碱酶酶解，发生分子链解体、断裂，再经加工所得产物[1]。胶原肽主要来源于骨骼、牛皮、猪皮、鱼类和家禽等[2-4]，作为小分子蛋白肽，具有生物可利用性，易分解，并能很好地被吸收到血液中，可在全身传播、修复和提供能量[5-8]。

Koji等[6]研究表明，口服胶原肽1～2 h后，可在人体血液中检测到羟脯氨酸浓度升至峰值，以肽的形式存在，主要是三肽Gly-Pro-Hyp。Kim等[9]研究表明，小分子胶原肽可从血管转移到表皮系统，从而刺激皮肤成纤维细胞合成胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸，改善皮肤的光滑度，增加皮肤的柔韧性和弹性。研究表明[10-11]细胞可将转移至组织中的多肽构建成完整的胶原螺旋，修复皮肤、骨骼和关节，对骨质疏松有一定预防和治疗作用。由于胶原肽富含多种氨基酸，具有营养和生理调节双重作用，广泛用于膳食食品、保健食品、美容食品、运动营养食品等领域[12-13]。

随着胶原肽市场规模增大，不同来源的胶原肽检测标准有所差异，表1为不同检测标准（依据国家标准/行业标准）中胶原肽的理化指标。相对分子质量、羟脯氨酸的含量是区别一般食品的关键质量参数，国标GB 31645-2018中胶原蛋白肽比鱼源胶原肽的指标范围宽泛，鱼源胶原肽的国家标准和行业标准中规定的胶原肽相对分子质量（Mr）和羟脯氨酸含量差异也较大。

表1 不同检测标准中胶原肽理化指标

由于标准指标的差异，市售鱼源胶原肽的产品质量信息基本相似，大多未标明低分子量氨基酸（Mr小于1000 ）占比，以及包含特征氨基酸羟脯氨酸在内的氨基酸组成差异，售价差异较大，消费者难以合理选择。因此本文选取了4种不同品牌，具有代表性的鱼源胶原肽产品与本实验室研制的胶原肽进行特征质量指标检测分析，旨在筛选出低分子量占比较高，特征性氨基酸羟脯氨酸较高的鱼源胶原肽，为鱼源胶原肽产品选择和功效研究提供实验依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

1.2 试剂

甲醇、乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；超纯水（实验室自制）；无水乙醇、盐酸、苯酚（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；三氟乙酸、十二水合磷酸氢二钠、十水合四硼酸钠、硼酸（分析纯，国药集团）；18种氨基酸标准溶液、OPA衍生试剂（岛津公司AJS-01 氨基酸柱前衍生化方法包）；细胞色素C（95 %，Mr：12 355）；抑肽酶（6000 U/mg，Mr：6511）；杆菌酶（Mr：1450）；乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（97 %，Mr：451）；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（97 %，Mr：189）。

产品1～4购于市场中不同品牌的胶原肽，X肽由本实验室研制，均为鱼源胶原肽。

2 方法

2.1 微波消解处理

将产品1～4和X肽每件样品准确称取约0.1 g，各置于微波消解罐中，已有样品的各消解罐中分别加入5 ml 盐酸（1 %苯酚）和5 ml 纯净水，进行微波消解，1600 W，150 ℃，15 min。微波消解程序完成并冷却后，分别将消解液定容至100 ml，各取出1 ml液体分别置于蒸发皿中60 ℃蒸发干燥后，各加入1 ml的稀盐酸将溶质溶出，置试管中待测。

2.2 GPC方法测定胶原肽相对分子质量

2.2.1 标准溶液的配制 精密称取相对分子质量标准的细胞色素C、抑肽酶、杆菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸适量，分别用流动相配制成浓度为1.0 g的不同相对分子质量的肽标准品溶液，用孔径为0.2 μm滤膜过滤后分别进样，得到系列标准品的色谱图。以相对分子质量的对数（lg Mr）对保留时间作图或作线性回归得到Mr校正曲线及其方程。

2.2.2 样品的配制 称取样品125.0 mg，用流动相溶解并定容至25 ml，超声振荡10 min，使样品充分溶解混匀，用孔径为0.2 µm，0.5 µm聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤，其滤液用于测定。

2.2.3 色谱条件 色谱柱：TSKgel G2000SWxL凝胶色谱柱（300 mm×7.8 mm，5 μm），流动相：乙腈-水-三氟乙酸（40:60:0.05）；检测波长：220 nm；流速：0.5 ml/min；柱温：30 ℃；进样体积：10 µl；等梯度洗脱。

2.3 OPA柱前衍生法测定胶原肽氨基酸含量

2.3.1 氨基酸标准混合溶液 含18种氨基酸，Asp（门冬氨酸）、Glu（谷氨酸）、Ser（丝氨酸）、His（组氨酸）、Gly（甘氨酸）、Thr（苏氨酸）、Arg（精氨酸）、Ala（丙氨酸）、Tyr（酪氨酸）、Val（缬氨酸）、Met（甲硫氨酸）、Ile（异亮氨酸）、Phe（苯丙氨酸）、Lys（赖氨酸）、Leu（亮氨酸）、Hyp（羟脯氨酸）、Pro（脯氨酸）浓度均为2.5 µmol/ml，Cys（半胱氨酸）为1.25 µmol/ml。

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2.3.2 衍生用混合氨基酸标准溶液的配制 量取氨基酸标准溶液100 µl，置入2 ml样品瓶，加入内标溶液50 µl，0.l mol/L盐酸溶液400 µl，混匀，作为衍生用混合氨基酸标准溶液。

2.3.3 衍生用游离氨基酸样品溶液的配制 准确称取样品适量，加0.l mol/L盐酸溶液制成氨基酸总浓度约为100 mg/ml溶液作为检测游离氨基酸样品溶液（溶液pH应不小于1.0），准确量取样品溶液500 µl，置入2 ml样品瓶，准确加入内标溶液50 µl，混匀，作为衍生用游离氨基酸样品溶液。

2.3.4 衍生用微波消解后样品溶液的配制 准确称取样品适量，加0.l mol/L盐酸溶液制成氨基酸总浓度约为1 mg/ml溶液作为检测微波消解后总氨基酸样品溶液（溶液pH应不小于1.0），准确量取样品溶液500 µl，置入2 ml样品瓶，准确加入内标溶液50 µl，混匀，作为衍生用微波消解后样品溶液。

2.3.5 色谱条件 色谱柱：AJS-02 氨基酸分析专用柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相A：0.45 %Na2HPO3·12H2O-0.475 %Na2B4O7·10H2O，pH 8.2；流动相B：甲醇-乙腈-水（450:450:100，v/v/v）；检测波长：UV 检测器：338 nm（一级氨基酸），262 nm（二级氨基酸）；流速：1.6 ml/min；柱温：50 ℃；梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序

3 结果与分析

3.1 胶原肽相对分子质量结果与分析

3.1.1 不同样品分子质量的分布情况 分别测定产品1～4和X肽，结果见图1，色谱图均较好地显示了5种不同来源胶原肽样品中不同分子质量的分布情况。

图1 不同样品的Mr色谱图

采用SHIMADZU GPC数据处理软件分别对以上色谱图进行处理。洗脱物质的分子质量随保留时间增加而减小。由图1可见，产品1～4的出峰时间相对一致，则分子质量大小差别不大，X肽出峰时间较晚，峰型相对单一，则X肽分子质量较小。产品1～4及X肽中一些主要色谱峰的保留时间、重均相对分子质量（Mw）、数均相对分子质量（Mn）、多分散系数d（Mw/Mn）的基本情况见表3。

由表3可见，产品1～4的Mw主要集中在1000～2000之间，X肽的Mw相对较小，主要集中在1000以下，占比约为88.47 %，比产品1～4Mw小于1000的低分子量组分占比高约92.75 %～115.62 %。

表3 不同产品相对分子质量及其分布测定结果

3.1.2 不同样品相对分子质量占比 对产品1～4和X肽进行了相对分子质量占比统计，结果见图2。

图2 不同胶原肽产品Mr占比

由图2可见，产品1～4中相对分子质量的占比大小基本相同，X肽中低分子量占比远高于市售样品的鱼源胶原肽。

3.2 胶原肽氨基酸结果与分析

3.2.1 氨基酸对照品 对20种氨基酸对照品进行高效液相分析，结果见图3。

图3 混合氨基酸对照品HPLC图

3.2.2 不同样品中游离氨基酸含量 将产品1～4和 X肽进行氨基酸分析，结果见图4。

由图4可见，各产品中游离氨基酸含量较少。产品1中精氨酸含量最高为67.37 µg/ml，其他17种氨基酸的含量均不超过50 µg/ml；产品2中丙氨酸的含量最高为112.18 µg/ml，其他均不超过50 µg/ml；产品3和产品4中氨基酸含量均不超过50 µg/ml；X肽中亮氨酸含量最高为65.79 µg/ml，其它均未超过40 µg/ml，其中羟脯氨酸的含量为0。上述结果表明，产品1～4和X肽中游离氨基酸浓度为0.2 %～0.5 %，表明样品主要以低聚肽的形式存在。

图4 市售样品和X肽中游离氨基酸含量

3.2.3 水解后不同样品游离氨基酸含量 对产品1～4和X肽按照“2.1”项方法微波消解后进行氨基酸分析，结果见图5。

图5 水解后不同样品中氨基酸含量

由图5可见，将市售样品和X肽水解后，各种氨基酸的含量均明显增加，多数氨基酸含量高于100 µg/ml，产品1～4和X肽氨基酸含量变化趋势较相似。产品2、产品3、产品4和X肽中谷氨酸含量约为300 µg/ml，产品1谷氨酸含量为229.67 µg/ml；各样品中甘氨酸含量约为500 µg/ml，精氨酸含量约为150 µg/ml，丙氨酸含量约为200 µg/ml。其中特征氨基酸羟脯氨酸和脯氨酸含量差别较大，X肽的羟脯氨酸（228.71 µg/ml）和脯氨酸（286.98 µg/ml）含量明显高于市售样品。

3.2.4 不同样品中肽氨基酸组成含量 各样品水解之后氨基酸含量减去未水解之前的氨基酸含量，得样品的肽氨基酸组成含量，结果见图6。

图6 不同样品中肽氨基酸组成含量

由图6可见，本次实验共检测18种氨基酸，X肽中有17种氨基酸含量高于产品1，13种氨基酸含量高于产品2，14种氨基酸含量高于产品3，13种氨基酸含量高于产品4；尤其特征性氨基酸羟脯氨酸和脯氨酸的含量（分别为228.71，166.41 µg/ml）远高于市售4种产品（羟脯氨酸分别为145.58，75.81，52.66，122.49 µg/ml，脯氨酸分别为208.3，170.57，166.41，196.16 µg/ml）。

3.2.5 羟脯氨酸在不同胶原肽产品中的比例 根据HPLC检测出的羟脯氨酸和脯氨酸的含量，计算羟脯氨酸和脯氨酸在胶原肽中的占比，结果见图7。

图7 羟脯氨酸和脯氨酸占比

由图7可见，X肽中羟脯氨酸含量较高，比产品1～4高约50.91% ～332.11 %；脯氨酸含量比产品1～4中含量高约33.91 %～71.41 %。

4 结论和讨论

不同鱼源胶原肽产品的低分子量组分占比、特征性氨基酸和其他氨基酸含量存在明显差别。本文以实验室研制的X肽与4种市售鱼源胶原肽微波消解后进行分子量大小和氨基酸含量比较。结果表明，X肽具有低分子量组分、羟脯氨酸、脯氨酸含量高的特点，更易被人体吸收和发挥功效。以上述关键质量指标为指针，通过优化不同来源底物、酶解工艺和筛选高活性肽段，达到降低产品用量提高产品功效的效果，将是以后研究的重点。同时，本文为胶原肽质量控制方法提供实验依据。