和力智能低温高效提取技术提取沙田柚中苦味物质含量测定研究

刘常青，苏雨苗，陈丽宜，宋力飞

（广州泽力医药科技有限公司，广东 广州 510700）

沙田柚Citrus grandis（L.）Osbeck cv. Shatian属于芸香科、柑橘属，是我国柚类的名种之一，原产于广西容县沙田村，后广泛栽培于广西、广东、江西、湖南等地。沙田柚果实较大，果皮色泽金黄，形似梨或葫芦，果肉晶莹饱满，带有清新香气，汁水少，口感清甜爽脆[1-3]。沙田柚营养丰富，富含蛋白质、糖、有机酸、果胶、纤维素、维生素C等物质，还包含一些天然活性成分，主要有黄酮类，香豆素类，柠檬苦素类，挥发油等[4-17]。沙田柚及其提取物具有抗癌、抑菌、降血糖、抗氧化、止咳祛痰、降血脂和防止动脉粥样硬化、抗炎镇痛等生理功能[18-20]。柠檬苦素和柚皮苷作为柚子中的主要苦味物质，是引起柚子苦涩气味的主要成分之一，具有抗焦虑，抗癌，抑菌，降低胆固醇，抗病毒等生理活性，其抗癌活性已成为研究热点[21-23]。

沙田柚于民国初年引进广东梅州，目前梅州已成为中国最大的沙田柚生产基地，2018年柚子及其他柑橘类品种栽培面积60.08万亩，年产量为94万吨，其中柚子产量79万吨[24]。沙田柚产业迅速发展同时，品质退化、品种良莠不齐、病虫害日趋严重、化学农药大量使用、系统规范的栽培管理技术缺乏、成熟高效的采后保鲜与深加工工艺缺乏等问题也日益突出[25]。

和力智能低温高效提取技术（HHLSE）能在室温下对物料进行提取，很好地保留原药材的物质成分及风味，较好地保持最终产物的原特征[26-27]。HHLSE提取过程包括粉碎、提取、分离、精制、浓缩等相应工序。本试验用梅州沙田柚作为原材，经HHLSE提取柚肉提取液、柚肉膜浓缩液；并建立沙田柚柠檬苦素含量的检测方法，采用中国药典[28]“化橘红”项下方法检测柚皮苷含量。通过对比沙田柚原材、提取液及膜浓缩液中柠檬苦素、柚皮苷的含量，为该经济作物综合开发利用提供依据，为沙田柚产业的可持续发展提供一定的理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

梅州沙田柚，产地为广东省梅州市五华县。

1.2 仪器

和力智能低温高效提取技术及成套设备（广州泽力医药科技有限公司）；高效液相色谱仪（岛津 LC-10AT VP PLUS）；TB-114电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；TU-1900 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Diamonsil C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.3 试剂

柠檬苦素对照品（批号：200606，纯度≥98 %，北京仪化通标科技有限公司）；柚皮苷对照品（批号：200802，纯度≥98 %，北京仪化通标科技有限公司）；甲醇分析纯（批号：20201022，天津市富宇精细化工有限公司）；乙腈色谱纯（批号：R141915，北京迪科马科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 柠檬苦素测定方法

2.1.1 色谱条件 Diamonsil C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.02 %磷酸溶液（42:58）；流速：1.1 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μl；检测波长：205 nm。

2.1.2 溶液的制备

2.1.2.1 柠檬苦素对照品溶液的制备 精密称取柠檬苦素对照品5 mg置入5 ml量瓶，用甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀即制得1.0 mg/ml对照品储备液；精密吸取0.5 ml 柠檬苦素对照品储备液，用甲醇稀释定容于10 ml量瓶，制成0.05 mg/ml对照品标准液。

2.1.2.2 供试品溶液的制备 将梅州沙田柚去皮、粉碎，取5 g细碎品，用甲醇超声提取并定容于50 ml量瓶，用0.45 μm滤膜滤过得柚肉原材供试品溶液；取柚肉原材20 kg，分别加纯水8倍、6倍进行提取，经HHLSE提取[27]后得到柚肉提取液、柚肉膜浓缩液，用0.45 μm滤膜滤过即得柚肉提取物供试品溶液。

2.1.3 测定波长的选择 取“2.2.1”项下所述对照品标准液，以甲醇作为溶剂空白，用紫外分光光度计在波长200～400 nm扫描，确定柠檬苦素最大吸收波长205 nm。

2.2 柚皮苷测定方法

2.2.1 色谱条件 柚皮苷色谱检验条件参考中国药典[26]“化橘红”项下方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-醋酸-水（35:4:61）为流动相；检测波长为283 nm。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于1000。

2.2.2 柚皮苷对照品溶液的制备 按照中国药典[26]“化橘红”项下的方法进行柚皮苷对照品溶液的制备。取柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含60 μg溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 同“2.1.2.2”项。

2.3 柚肉柠檬苦素含量测定方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下的柠檬苦素对照品储备液，用甲醇分别稀释配制成0.002，0.005，0.02，0.05，0.1，0.5，1.0 mg/ml质量浓度的柠檬苦素对照品溶液，按照“2.1”项色谱条件测定。以测得峰面积为横坐标（X），相对进样的浓度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得柠檬苦素的回归方程。以S/N=3信噪比计，测定方法的最低检测浓度。结果：柠檬苦素的回归方程Y=2.635×10-7X-0.045，r=0.990，柠檬苦素在0.05～1 μg的范围内具有良好的线性关系，方法的最低检测限为0.5 ng。

2.3.2 精密度试验 取柠檬苦素对照品标准液，按照“2.1”项色谱条件连续进样5次，以测得柠檬苦素的峰面积A为指标，测得平均峰面积A为36543，相对标准偏差RSD为1.39 %，表明该方法精密度良好。

2.3.3 重现性试验 分别取同一批梅州沙田柚肉提取物，平行取样5份供试液，按照“2.1”项色谱条件进样10 μl测定，以测得峰面积A为指标，测得平均峰面积A为113663，计算相对标准偏差RSD为2.59 %，表明该方法的重现性良好。

2.3.4 稳定性试验 分别取同一批梅州沙田柚肉提取物，分别于0，2，4，6，8 h按照“2.1”项色谱条件进样10 μl测定，以测得峰面积A为指标，测得平均峰面积A为46449，计算相对标准偏差RSD为2.33 %，表明该方法稳定性良好。

2.3.5 加样回收试验 按照高、中、低3个浓度梯度，精密移取已知含量的柚肉提取物样品，加入不同量的柠檬苦素标准溶液，按照“2.1”项色谱条件重复测定3次，计算回收率，见表1。由表1可见，柠檬苦素的加样回收率为99.60 %～100.96 %，RSD为0.50 %～1.83 %。

表1 加样回收率实验结果（n=3）

2.4 样品的测定

取梅州沙田柚原材、提取液及膜浓缩液，按照“2.1”项色谱条件测定柠檬苦素含量，按照“2.2”项下检测方法测定柚皮苷含量。结果见表2～表3。

表2 沙田柚原材及提取物柠檬苦素的含量分析（n=3）

表3 沙田柚原材及提取物柚皮苷的含量分析（n=3）

3 结论与讨论

本试验采用HHLSE提取梅州沙田柚果肉，得到柚肉提取液和膜浓缩液，采用高效液相色谱法检测样品柠檬苦素含量，建立了检测柚肉柠檬苦素的方法。方法学考察试验结果表明，此法具有良好的线性关系，精密度、重现性、稳定性及加样回收率良好，柠檬苦素分离度及峰型较好，可作为检测柚肉柠檬苦素的方法。

HHLSE提取过程包括粉碎、提取、分离、精制、浓缩等相应工序。试验结果表明，该提取工艺保留了沙田柚果肉中大部分的柠檬苦素、柚皮苷，提取率较高，同时作为一种低温瞬提技术，又能较好的保持柚肉原材的风味和营养物质，可作为一种低温、高效的提取柚肉柠檬苦素及柚皮苷的工艺技术。

梅州市作为金柚之乡，当前的金柚产业面临着从“中期控质”到“后期功能延伸”的关键环节[29-30]。目前国内外对沙田柚的研究主要集中在栽培管理技术，精深加工方面，精深加工产品主要在凉果领域，特别是以果皮精油和果胶为主，其他活性物质如水溶性多糖等也已经成为新的研究热点[31]。药用方面研究应用与产品则少之又少。本研究结果表明，柚肉中含有丰富的柠檬苦素、柚皮苷，可制成具有理气化痰功效的饮料，也可作为提取柠檬苦素、柚皮苷原料，这与魏华强[32]等研究结果一致。对梅州沙田柚进行综合利用研究，不但可提高企业的经济效益，还利于梅州沙田柚产业可持续发展的循环经济之路。