不同醋制方法对决明子指标成分的影响

李筱玲，何长安，高珂欣，邓寒霜，张 飞

（1. 商洛学院，陕西 商洛 726000；2. 陕西天士力植物药业有限责任公司，陕西 商洛 726000）

决明子为豆科植物钝叶决明Cassia obtusifolia L.或决明（小决明）Cassia tora L.的干燥成熟种子[1]。其性微寒，味苦、甘、咸，入肝、肾、大肠经；是我国传统中医常用中草药，具有润肠通便，清肝明目的功效[2]。决明子为药食两用药，有效成分主要为蒽醌类化合物[3]。其中所含游离蒽醌及结合蒽醌均具有降血脂、降血压、抗氧化、保肝等作用，临床应用广泛[4-5]。其内在质量评价多以橙黄决明素、大黄酚为指标，2020年版《中国药典》规定决明子含大黄酚（C15H10O4）不得少于0.20 %，含橙黄决明素（C17H14O7）不得少于0.080 %，其含量测定方法多用HPLC法[6-8]。长期或大剂量服用决明子会引发一定的肝肾毒性，其毒性与结合蒽醌的含量相关，结合蒽醌含量越低，毒性越低[9]。目前决明子的临床应用饮片主要有两种，即生决明子和炒决明子。古人用“以苦酒渍经三日暴干”的炮制方法炮制决明子，现代研究结果也表明醋制决明子后，游离蒽醌的含量显著提高，是生品的4倍，是清炒品的近2倍[10]。因为决明子中很多蒽醌类成分是以结合蒽醌形式存在，醋制的过程引入了醋酸，而结合蒽醌对醋酸敏感，使其水解转变为游离蒽醌；加之炮制过程受热影响，湿热条件下，结合蒽醌也可能被酶解，游离蒽醌含量增加。因此，对决明子醋制工艺进行研究非常有必要，可确保决明子的用药安全性。同时醋制引药入肝，可提高决明子清肝明目的作用，增强其功效。本文以橙黄决明素、大黄酚2种成分的含量为评价指标，采用单因素结合正交试验法，对影响醋制决明子品质的加醋量、闷润时间、烘制温度、烘制时间等4个因素水平进行了考察，以期为决明子饮片的炮制工艺研究提供一定的帮助。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent HP1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；KQ5200DB 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ML204万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；750T型多功能粉碎机（铂欧五金厂）；UV-2082 紫外-可见分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]。

1.2 试药

决明子，购自陕西省商洛市香菊大药房（宁县康盛园药业有限在责任公司生产，批号：Y18110803）；9度纯酿米醋（佛山市海天调味食品股份有限责任公司）；乙腈[色谱纯，利安隆博华（天津）医药化学有限公司]；三氯甲烷、乙醇等（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；大黄酚对照品（批号：171118）、橙黄决明素对照品（批号：171218），由北京世纪奥科生物技术有限公司提供，纯度均大于99 %。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 对照品溶液制备 取大黄酚对照品、橙黄决明素对照品适量，精密称定，加无水乙醇-乙酸乙酯（2:1）混合溶液制备混合对照品，得2种对照品实际浓度分别为35.2，23.3 µg/ml 。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 ml蒸干，加稀盐酸30 ml，置水浴中加热水解1 h，立即冷却，用三氯甲烷振摇提取4次，每次30 ml，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯（2:1）混合溶液使溶解，转移至25 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.1.3 色谱条件 Hypersil Gold C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈作为流动相A，0.1 %磷酸溶液作为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为284 nm，柱温30 ℃，流速1 ml/min；理论塔板数按橙黄决明素峰计不低于3000。在此色谱条件下，样品中各色谱峰分离度均可达到1.5以上。

表1 流动相梯度洗脱表

2.1.4 样品测定 取各试验处理所得决明子样品适量，照“2.1.2”项中方法制备供试品溶液，以0.45 µm微孔滤膜滤过，精密吸取滤液10 µl进样，照“2.1.3”项进行HPLC分析，记录色谱图，计算橙黄决明素和大黄酚的含量。

2.2 系统适应性试验

2.2.1 专属性试验 照“2.1.1”项方法分别制备橙黄决明素、大黄酚单一对照品和阴性对照溶液；照“2.1.3”项进行HPLC分析，记录色谱图。结果表明，各样品中橙黄决明素、大黄酚的保留时间与对照品一致，2个对照品色谱峰的理论塔板数均在9000以上，单对照品及阴性对照色谱图均显示，无其他杂质组分干扰含量测定结果。各组分色谱图见图1 。

图1 各成分HPLC色谱图

2.2.2 线性关系考察 分别精密吸取2，4，8，10，16，20 µl对照品溶液注入液相色谱仪，照“2.1.3”项进行分析。以浓度（µg/ml）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程。得橙黄决明素的线性回归方程是Y=45 717X+239.42，R²=0.9998；大黄酚的线性回归方程是Y=19 041X+9371.8，R²=0.9998。橙黄决明素在浓度为4.66～46.6 µg/ml之间具有良好线性关系，大黄酚在浓度为7.04～70.4 µg/ml之间具有良好线性关系。

2.2.3 精密度试验 精密吸取大黄酚、橙黄决明素混合对照品溶液10 μl，照“2.1.3”项进行HPLC分析，连续进样5次。以大黄酚、橙黄决明素色谱峰面积计算RSD，分别为1.27 %，1.16 %，表明仪器具有良好的精密度。

2.2.4 重复性试验 取同一决明子样品，照“2.1.2”项方法，平行处理5份供试品溶液，照“2.1.3”项进行HPLC分析。以大黄酚、橙黄决明素色谱峰面积计算RSD，分别为1.57 %，2.34 %，表明所用供试品制备方法具有良好的重复性。

2.2.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，照“2.1.3”项进行HPLC分析，每间隔0，2，4，6，8，12 h进样，以大黄酚、橙黄决明素色谱峰面积计算RSD，分别为1.28 %，0.95 %，表明供试品溶液在12 h内具有良好的稳定性。

2.2.6 加样回收试验 取已知含量的醋制决明子样品9份，每份0.5 g，精密称定重量，平均分成3组，按低、中、高浓度分别加入混合对照溶液，每组3个重复，按“2.1.2”项制备供试品溶液，照“2.1.3”项进行HPLC分析，计算加样回收率，结果表明橙黄决明素、大黄酚平均回收率分别为99.2 %，99.6 %，RSD分别为1.78 %，1.34 %，说明所用检测方法具有良好的准确性。

2.3 单因素试验

以加醋量、闷润时间、烘制时间、烘制温度4个因素为考察对象，每因素设5个不同水平，以橙黄决明素、大黄酚含量进行综合评分。综合评分标准为，橙黄决明素含量权重60分，大黄酚含量权重40分。计算公式如下：

综合评分=橙黄决明素含量×60+大黄酚含量×40

2.3.1 加醋量的影响 取10份同批决明子样品，等分为5组，分别加入样品量10 %，20 %，30 %，40 %，50 %的米醋，其他条件固定为，闷润时间1 h、烘制温度60 ℃、烘制时间3 h，每组2个重复，考察加醋量对醋制决明子质量的影响，结果表明加醋量为30 %为最佳。

2.3.2 闷润时间的影响 取10份同批决明子样品，等分为5组，分别闷润1，2，3，4，5 h，其他条件固定为，加醋量30 %、烘制温度60 ℃、烘制时间3 h，每组2个重复，考察闷润时间对醋制决明子质量的影响，结果表明闷润3 h为最佳。

2.3.3 烘制温度的影响 取10份同批决明子样品，等分为5组，分别在40，50，60，70，80 ℃下烘制，其他条件固定为，加醋量30 %、闷润时间3 h、烘制时间3 h，每组2个重复，考察烘制温度对醋制决明子质量的影响，结果表明在80℃下烘制为最佳。

2.3.4 烘制时间的影响 取10份同批决明子样品，等分为5组，分别烘制1，2，3，4，5 h，其他条件固定为，加醋量30 %、闷润时间3 h、烘制温度80℃，每组2个重复，考察烘制时间对醋制决明子质量的影响，结果表明烘制4 h为最佳。

2.4 正交试验设计与结果

取单因素试验所得优水平为中间水平，分别对加醋量（A）、闷润时间（B）、烘制温度（C）、烘制时间（D）进行4因素3水平正交试验，评价办法与单因素试验相同。正交试验因素水平设置见表2，每个试验条件平行处理2份样品，试验结果见表3，方差分析见表4。

表2 决明子醋制工艺正交试验因素水平设置

表3 决明子醋制工艺正交试验结果

表4 正交试验方差分析结果

由表3、表4可见，各因素对醋制决明子品质影响大小顺序为A（加醋量）>C（烘制温度）>D（烘制时间）>B（闷润时间），其中加醋量与烘制温度对试验结果有显著性影响。由结果可见，醋制决明子的最佳炮制工艺条件为A2B3C2D3。即加醋量30 %、闷润4 h、烘制温度80 ℃、烘制5 h。

2.5 验证试验

因优选出的最佳处理条件并未出现在正交试验中，为确保研究结果的准确性，本文对最优工艺进行了验证。具体方法如下，称取同批决明子药材3份，每份50 g，分别加入15 ml米醋，拌匀，闷润4 h后，在80 ℃下烘制5 h。照前述方法检测得橙黄决明素、大黄酚含量平均值分别为0.183 %、0.341 %，平均综合评分为24.62（RSD为1.9 %），高于全部9个正交试验处理，表明所优选出的最优工艺条件真实可信、重复性好，可为决明子饮片炮制生产实际提供参考。

3 结论与讨论

决明子有效成分主要为蒽醌类物质。其中，结合蒽醌是泻下主要成分，有一定毒性；游离蒽醌为抗菌主要成分，并有降血脂、降血压、抗氧化等作用。橙黄决明素、大黄酚均为游离蒽醌，是决明子降脂主要成分，因此以橙黄决明素、大黄酚的含量为决明子饮片质量评价指标，具有一定的合理性，有一定的实际指导意义。

决明子有醋制、炒制（清炒、盐炒）和酒制等炮制规格，不同的炮制方法、炮制工艺条件对决明子中有效成分的含量有很大的影响。目前有关决明子炮制方法的研究主要集中在清炒品方面，对决明子其他传统炮制方法的报道甚少，特别是关于醋制决明子的工艺研究未见有报道。

本课题组在前期研究中，采用醋炙、醋蒸、醋煮、醋烘、醋闷等不同方法对决明子进行了炮制，发现醋烘法所得饮片中总蒽醌的含量为0.680 %（以1,8-二羟基蒽醌为对照品，用0.6 %醋酸镁甲醇溶液显色，采用紫外-可见分光光度法在520 nm检测），是5种方法中仅次于醋蒸法（0.687 %）的，接近于生品（0.742 %）；同时发现，醋烘法所得饮片的橙黄决明素含量最高为0.15 %，大黄酚为0.27 %，也高于生品（0.13 %，0.26 %）。考虑到醋烘法相较于醋蒸法，可简化操作环节，提高工作效率，有利于大规模生产，故本文对以烘法炮制醋决明子的最佳工艺进行了研究，最终确定醋制决明子的最优炮制艺条件为：加醋量30 %，闷润时间4 h，烘干温度80℃，烘干时间为5 h。经验证试验，在此最优条件下炮制所得醋制决明子中橙黄决明素和大黄酚含量平均值分别为0.183 %，0.341 %，较之前工艺所得饮片含量有明显增加，表明本研究成果具有一定的应用价值。