两株石油降解真菌生物学特性及降解能力研究

覃俊艳

（百色市食品药品检验所，广西 百色 533000）

石油烃类污染物一旦流入海洋，对人类健康、海洋动植物及微生物、旅游业等多方面都会造成严重危害，甚至威胁人类和动物的生命。鉴于石油烃类污染的危害性大，这类污染防治引起了世界各国的重视。化学修复、物理修复、生物修复是当前已知且常用的三大环境修复方式，其中生物修复技术具备污染少、效益高、投资低、风险小等优势，是公认的发展潜力较大的环境修复方式，为解决复杂的环境污染问题提供了新思路。石油是一种复杂混合物，主要由链烷烃、芳香烃、环烷烃以及少量非烃化合物组成，是很多微生物的生长所需要的碳源，甚至有些微生物是将其作为唯一碳源。这些微生物能通过氧化反应将石油烃转化为低分子化合物被生物体利用合成自身细胞成分，一些也可以氧化成CO2和H2O，循环进入大气。本课题的目的就是从自然海洋环境中筛选出能够高效降解石油的菌株，从温度、含油量、pH 值、菌液浓度等条件对这两株菌进行研究，优化参数条件，提高降解效果，最终为生物修复石油烃污染提供理论和技术参考。

一、材料与方法

（一）实验材料的采集和处理

相关工作人员需要采集海水、海泥、海洋动物、藻类等样品，然后立即装到无菌采样袋中，低温保存送回实验室及时处理。无菌称取5g 样品，放入无菌锥形瓶中，并倒入10 倍体积的无菌海水，旋涡振荡，使其充分混匀制成悬浊液。

（二）菌种富集培养

无菌量取一种样品的菌悬液10mL 加入装有100mL 富集培养液的锥形瓶中，富集培养液包括三种：(Ⅰ)富集培养液Ⅰ(无机盐培养液)：NaNO32g，K2HPO41.81g，MgSO4·7H2O0.1g；CaCl20.01g，FeSO4·7H2O0.01g，石油烃1%，pH 值为7；(Ⅱ)富集培养液Ⅱ(牛肉膏蛋白胨培养液)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，石油烃0.5%，pH 值为7；(Ⅲ)富集培养液Ⅲ(马丁氏培养液)：0.03%孟加拉红100mL，MgSO4·7H2O0.5g，KH2PO41g，葡萄糖10g，蛋白胨5g，石油烃0.5%，pH 值为7；培养液和培养基均用陈海水配制，石油烃：柴油体积比1:4。在28℃环境下，连续振荡培养7 天，之后取其上清液10mL，转接入新鲜相应的液体培养基中。上述步骤需要被连续重复，直到完成富集培养2 次。以相同的方法富集培养其他样品中的微生物。

（三）菌株纯化

1.稀释涂布平板法：将菌悬液于无菌海水中，按1 ∶9(V/V)比例稀释，分别将稀释度为10-3，10-4，10-5 的稀释液，吸取20uL 注入PDA 平板和马丁氏平板中，涂布，倒置培养7 天，接下来进行纯化，直至获得纯培养，同时观察记录菌落特征和镜检。2.平板划线分离法。稀释涂布平板法效果不理想则考虑使用此种方法。

（四）菌株驯化

在富集培养液Ⅱ中增加石油烃的浓度，梯度为0.7%、0.9%、1.0%，加入菌液50uL 到盛有5mL 的试管中，30℃下振荡培养7 天，振荡频率为160r/min。一个周期后将步骤重复，继续30℃振荡培养7 天。

（五）石油含量与降解率测定方法

1.采用紫外分光光度法测定石油含量。用石油醚作为石油萃取剂，用紫外分光光度计在200～300nm 处扫描，吸收峰出现在227nm 处，因此选用227nm 进行分析可提高实验的准确性及灵敏度。2.菌种菌悬液的配制。观察驯化结果，选取出降解较明显的菌种。依次稀释至适当浓度，然后将适当浓度的菌液滴加在细胞计数板上，进行计数。根据数值配制菌液浓度为2.6-3.0×108 个/mL。3.菌种降解率的测定。分别配制石油烃的浓度为0.5%、0.7%、0.9%的培养液Ⅱ和PDA 培养液，取1.0mL 分离驯化得到的效果较好的纯菌株分别接入到含20mL 的上述培养液的100mL 的锥形瓶中，在30℃，160r/min 的条件下培养6d。同时，不加菌液做空白对照。

分别在锥形瓶中加入2.0mL 的硫酸(1:3)，2.0mL 的正己烷，然后全量转入梨形分液漏斗（60mL）中，之后在漏斗中加入正己烷3.0mL，并振荡2min(注意放气)，最后静置分层。待分层之后，将下层水样放入原瓶中。漏斗颈内的水分要用滤纸卷吸干。将正己烷萃取液放入比色管中，比色管容量为10mL，并带刻度。振荡原样瓶，将萃取过的水样倒回分液漏斗中，加入5.0mL 的正己烷重复萃取一次，将萃取液合并于带刻度的比色管中，用正己烷定容至标线。

采用紫外分光光度法测定原样中石油烃的含量。降解率计算公式：降解率(%)=(A0—A)/A0，A0——对照组测定残油的吸光度值，A——待测样中降解后残油的吸光度值。

二、结果与分析

（一）初步鉴定：菌株F1 和F2 的鉴定

1.菌株F1 和F2 的菌落特征如下：

2.菌株显微鉴定。在20 倍的显微镜下观察两个菌株两次富集驯化培养后菌丝团的图片如下：

从菌株F1 和F2 的初次、再次富集图片可以看出这两个菌株降解石油的能力是可以通过驯化逐步提高的。

在40 倍显微镜下得到菌株F1 和F2 的显微照片，见下图：

从图2.7 中，可以看到真菌F1 的细胞结构中有青霉的特征：孢子顶端膨起成扫帚状。从图2.8 中，可以看到芽枝孢子的特殊结构：孢子不是平滑的，其顶端有芽。通过对比真菌青霉和芽枝孢子的结构图片，确定了这两种真菌的属类，F1 是青霉属(Penicillium)，F2 是芽枝属(Cladosporium)。

（二）降解石油烃的海洋真菌的降解能力分析

1.温度。实验温度设定为16、22、28、34℃等4 个温度梯度试验组，160r/min，pH7，石油含量为0.7%，振荡培养7 天，同时不加菌液做对照，7 天后测定降解率，观察得知，两株菌在15～35℃范围内都可以生长，温度对微生物石油降解能力的影响较大，具体表现为两株菌的石油降解能力在一定范围内与温度呈正向相关。二者石油降解能力随着升高而提升，当环境温度达到28℃时达到最大值，随着温度的继续升高，它们的石油降解率均有所降低。温度超过34℃时，两株菌的石油降解率和生长量均呈降低趋势。因为，微生物生长代谢与温度有关，当温度高于34℃时，菌株的酶活性逐渐降低。另外，石油烃对微生物细胞膜的毒性也逐渐加剧，限制了石油烃的降解。

2.石油浓度。实验选择在石油含量为0.5%，0.7%，0.9%等3 个石油浓度梯度试验组，28℃，160r/min，pH7，振荡培养7 天，同时不加菌液做对照，7 天后测定降解率，可以看出，两株菌在0.5～0.9%浓度范围内都可以生长，石油浓度对微生物石油降解能力有较大影响，在石油浓度为0.7%时，微生物石油降解能力最大。因为，作为该实验中微生物生长所需的唯一碳源，石油浓度过低时不能满足大量微生物生长代谢和繁殖的相关需求，会导致除油量减小。当石油浓度增大到适于微生物生长时，它们就会快速繁殖，继而菌体数量增加，石油也被快速有效的分解利用，表现为除油量大幅度提高。而当石油浓度过高时，会对微生物生长代谢产生抑制作用，甚至杀死微生物细胞，对石油降解产生影响。

3.pH 值。实验设定了石油降解培养基的pH 值为4、5、6、7、8 等4 个不同pH值梯度试验组，石油含量为0.7%，28℃，160r/min，振荡培养7 天，同时不加菌液做对照，7 天后测定降解率，可以看出，两株菌在pH 值4～8 范围内都可以生长，pH 值对微生物的生长繁殖及其降解石油效率均产生了不同程度的影响，在pH 值为4-7这个范围内，降解率随着pH 值增大而增大，当pH 值为7 时，降解率上升至最大。当pH 值大于7 时，微生物石油降解效率随着pH 值上升而降低，说明碱性海水不适合这两种菌株生长。

4.菌液浓度。选择菌液浓度为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%等6 个不同菌液浓度梯度试验组，pH 值为7，石油含量为0.7%，28℃，160r/min，振荡培养7 天，同时不加菌液做对照，7 天后测定降解率，分析结果可知，石油降解率随菌液浓度增加而升高，当菌液浓度为2.5%时降解率达到最高，之后两种真菌的降解率随着菌液浓度提升而下降。由此可见，要利用微生物对石油进行有效的降解，必须将菌液浓度控制在合理范围内。因为，菌液浓度太小，菌体很难快速适应新的生长环境，其生长期延长，不利于石油降解；反之，则造成碳源短缺，菌体之间竞争营养物质，同样不利于新生菌体的生长，从而影响石油降解。

三、结论

1.从海洋动植物体内分离的微生物大多数具有降解石油烃的能力。2.分离出两株真菌具有很好的降解石油烃的能力，分别为青霉属(Penicillium)和芽枝属(Cladosporium)，对石油烃的降解率达45%以上。3.从不同温度、石油浓度、pH 值、菌液浓度4 个条件，探讨和研究两株真菌的降解效果，得出相对优化的条件，相关的探讨有待进一步深入研究。