甘氨酸甲基转移酶在肺癌及癌旁组织中的表达及临床意义

孙临奥 李昌盛 周雪峰

甘氨酸甲基转移酶(glycine N-methytransferase，GNMT)是调节生物甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的肝脏甲基转移酶[1]，在多种癌症中有抑制癌细胞增殖的作用[2]。GNMT的缺失在肝癌的发生发展中起着重要的作用[3]。GNMT同样也被作为前列腺癌的潜在生物标志物[4]。我们对GNMT在肺癌中的作用以及对病人预后评估作用进行研究。

对象与方法

一、对象

2015年6月～2020年6月间我院胸心血管外科收治的肺癌及癌旁组织标本140对，病人平均年龄54.47岁(34～78岁)，男79例，女61例。入组标准：(1)术前未行新辅助治疗；(2)签署手术知情同意书及标本获取知情同意书；(3)由两名以上病理医师做出诊断。TNM分期采用IASLC第八版肺癌分期。均行手术治疗，并经病理检查诊断为肺腺癌 117例，鳞癌 23例。有吸烟史101例，无吸烟史39例，年龄≤55岁63例，年龄>55岁77例。伴有淋巴结转移31例，不伴淋巴结转移109例。肿块直径≥3 cm 48例，肿块直径<3 cm 92例。TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分别为55例、58例和27例。肿瘤高、中、低分化分别为58例、45例和37例。术后所有病人分别随访6～60个月。

二、方法

1.全部癌旁组织标本均取自于离肿瘤>3 cm处。自病历系统中获取性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小、分化程度等临床特征，分析GNMT表达与肺癌病人临床病理特征及预后的关系。

2.实验方法：(1)逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)：所有组织标本离体后立即用液氮罐收集并储存于-80 ℃冰箱中。采用TRIzol提取总RNA，用QuantiFast RT-PCR试剂盒反转录成cDNA，QuantiTect-SYBR-Green-PCR检测Dock10的表达。GAPDH作为内参。GNMT引物序列为：5′-ATGCTGTCATCTGCCTTGGAAAC-3′和5′-GCCTGTACTGAGGATGTGGTCGT-3′，GAPDH序列为：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′和5′-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′。(2)蛋白免疫印迹实验(Western-blotting)：使用RIPA裂解液提取组织总蛋白，用10%SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移至PVDF膜。用5%无脂牛奶在TBST中封闭膜30分钟，然后加入相应的一抗GAPDH(Proteintech，货号：10494-1-AP)及GNMT(Proteintech，货号：18790-1-AP)4 ℃下孵育过夜。在TBST中洗涤3次，每次5分钟后，在室温下用2.5%脱脂乳在TBST中与二抗孵育膜1小时。每张膜滴加适量的ECL底物，孵育数分钟后X光胶片压片后。放入显影液及定影液中显影及定影。(3)酶联免疫吸附剂测定(ELISA)：使用GNMT ELISA试剂盒，并依照试剂盒说明，准备试剂，样品及标准样品。加入样品或标准样品至每个孔中，于37 ℃条件下，孵育2小时,加入试剂A，再次于37 ℃条件下，孵育1小时,吸出反应液后重复洗3次，再加入试剂B，于37 ℃条件下，孵育30分钟,吸出反应液后反复洗5次，在加入90 μl反应底物后于37 ℃条件下，孵育20分钟，加入50 μl终止液，于450 nm波长分光光度仪器检测吸光值，以空白对照孔调零后测各孔OD值。

三、统计学方法

结果

1.肺癌和癌旁组织中GNMT mRNA与蛋白的表达水平：利用RT-qPCR和Western-blot法来检测肺癌及癌旁组织中的GNMT mRNA与蛋白的表达水平。结果显示，肺癌组织(T)中GNMT mRNA表达水平低于癌旁组织(N)。癌旁组织GNMT蛋白表达水平高于癌组织(图1)。图中列出3例典型癌与癌旁组织GNMT表达情况，其余137对标本癌旁组织GNMT蛋白表达水平不同程度的高于癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

T表示癌组织，N表示癌旁组织

2.肺癌和癌旁组织中GNMT的表达量：用ELISA检测肺癌及癌旁组织中的GNMT表达，肺癌组织中GNMT表达的平均值为(632.21±19.43)ng/ml，癌旁组织中GNMT表达的平均值为(503.17±22.61)ng/ml。肺癌组织中的GNMT表达低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

3.GNMT在肺癌中的表达与临床病理特征的关系见表1。进一步分析GNMT在肺癌中的表达与临床病理特征的关系，结果显示，GNMT高表达与淋巴结转移、肿瘤大小、TNM分期显著负相关，与肿瘤分化程度呈正相关(P<0.05)，与年龄、性别、吸烟史无关(P>0.05)。

表1 GNMT表达量与肺癌病人临床病理特征的关系

4.GNMT表达与肺癌病人预后的关系见表2。肺癌病人癌组织内GNMT表达量高于平均值的为高表达，Kaplan-Meier法显示，GNMT高表达病人的中位生存期为45个月，明显高于GNMT低表达病人(34个月)(P<0.05)(图2)。多因素Cox回归分析显示，肺癌病人生存期与性别、年龄、吸烟史无相关性，而与淋巴结转移、TNM、分化程度、肿瘤大小以及GNMT表达相关(P<0.05)。因此，可以得出GNMT是肺癌的独立预后因素。

表2 肺癌病人生存期相关的危险因素分析

图2 GNMT不同表达水平肺癌病人生存分析

讨论

肺癌是目前全球发病率最高的恶性肿瘤之一，肺癌的早期检测及对肺癌病人的预后评估仍然缺乏有效的指标，对于肺癌病人的预后评估以及诊断手段的探索是临床研究的热点[5]。肺癌在临床工作发现时多已是TNM分期较高[6]。在肺癌的发生和发展中，肺癌所在的微环境起着重要的作用，机体的酶与蛋白等其他化学物质在肺癌的发生和发展中起重要作用[7]。控制肺癌发生、发展，评估肺癌预后的有效指标显得尤为重要，尤其是多层次方面的控制与评估[8]。GNMT主要在恶性肿瘤中发挥作用，通过蛋白质在癌细胞中的瞬时表达诱导细胞凋亡，并导致ERK1/2的激活作为早期的抑制作用。GNMT的抗增殖作用可以通过用泛半胱氨酸蛋白酶抑制剂zVAD-fmk治疗而部分逆转。凋亡的诱导与GNMT核定位有关[9]。本研究分析GNMT与肺癌生物学特征以及与病人预后的关系。

本研究结果表明，肺癌组织中GNMT mRNA及蛋白水平低于癌旁组织。肺癌组织中GNMT表达量低于癌旁组织。随着病人TNM分期的升高，病人肺癌组织中GNMT的表达也逐渐降低。这说明GNMT在肺癌中起抑制作用。有研究表明，在乳腺癌肺转移病人中GNMT较其他部位转移表达更低[10]，本研究中淋巴结转移病人GNMT表达更低，说明GNMT在肺的恶性肿瘤中有抑制作用。GNMT基因敲除的小鼠中，肉瘤样肝癌的发生率更高，癌组织增殖更快[11]，提示在肝癌中GNMT的抑癌作用十分明确。在肺癌中肿块更大的病人GNMT的表达水平明显降低。GNMT的升高预示着病人生存期延长。因此，GNMT在肺癌中的作用为抑癌作用并能预示病人的生存期。GNMT通过在高蛋氨酸或低S-腺苷甲硫氨酸(SAM)条件下产生肌氨酸来缓冲SAM水平，促进SAM分解代谢可延长果蝇的寿命[12]，这与我们分析的GNMT高表达的病人的生存期更长的结果是相符合的。

有研究表明，GNMT是原发性肝癌的肿瘤抑制因子，miR-224在原发性肝癌中充当促癌基因miRNA，含有GNMT编码序列的miR-224结合位点沉默突变的GNMT-MT质粒可以逃避HEK293T细胞中miR-224的抑制。miR-224减弱了GNMT对抑制细胞增殖和肿瘤生长的影响[13]。GNMT参与甲基供应、DNA甲基化和核苷酸生物合成。它调节细胞S-腺苷甲硫氨酸与S-腺苷同型半胱氨酸的比率和S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移反应。GNMT在快速生长的肝细胞癌中不表达，而在生长缓慢的肝癌中则呈低水平表达。GNMT通过与含有雷帕霉素(mTor)作用蛋白的Dep结构域相互作用来抑制肝细胞癌的生长。它支持嘧啶和嘌呤的合成，并最大限度地减少叶酸耗竭后尿嘧啶与DNA的结合。有研究表明，靶向细胞核的GNMT仍然发挥着强大的抗增殖作用[14]。在前列腺癌中，雄激素受体表达细胞中的GNMT表达受到雄激素的刺激，这种刺激发生在mRNA和蛋白质水平上，GNMT在与雄激素受体靶向结合后产生抑制前列腺癌的增殖作用[15]。GNMT所诱导产生的S-腺苷甲硫氨酸可以被作为一种化学预防剂对肝癌和其他形式的癌症产生抑制作用[16]。在肺癌中，GNMT还与癌组织的病理形态有关系，低分化肺癌的GNMT表达水平明显降低，说明分化程度越高GNMT表达越高。由此可见，GNMT在多种癌症当中发挥着抑癌因子的作用。

在肺癌组织中，GNMT的表达量明显低于癌旁组织中的表达量，分化程度越低、TNM分期越高的病人，GNMT的表达量越低，生存期越长的病人GNMT表达越高。总之，GNMT在肺癌中可能起着抑制肿瘤发生发展的作用，并能预测病人的预后。