基于网络药理学预测紫苏子-杏仁药对治疗支气管哮喘的作用机制

黄芳芳，吴锐剑，李晓玲，林浩雯，邱 琴，林柏忻，黄宇戈，罗连响 （广东医科大学.研究生院；.实验动物中心；.第一临床学院；.附属医院；5.海洋医药研究院，广东湛江50）

支气管哮喘(简称哮喘)是由多种细胞及细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，伴有可变的气流受限和气道高反应性[1]。据估计，全球约有3 亿人患有哮喘[2]。糖皮质激素是目前控制哮喘气道炎症最有效的药物，慢性持续期哮喘以吸入为首选给药途径[1,3]，但由于吸入糖皮质激素治疗依从性差等原因，目前哮喘控制率仍较低。而且长期高剂量吸入糖皮质激素可出现全身不良反应（如肾上腺皮质轴抑制、骨质疏松等[1]），因此急需寻求治疗哮喘的药物和方法。

中医药治疗哮喘已有悠久的历史，在治疗哮喘的经典名方（如定喘汤、麻杏石甘汤、麻黄汤等）中，紫苏子和杏仁常作为君药或臣药使用，两者均具有降气化痰、止咳平喘、润肠通便的功效[4-5]，可对哮喘的治疗起到一定的作用。目前有研究表明，紫苏子-杏仁药对是今方中治疗支气管哮喘支持度前十的高频药对[6]。然而，现有关于紫苏子-杏仁药对的研究仍较少，对其作用机制的研究也局限于方剂或者单药，故紫苏子-杏仁药对治疗哮喘的作用机制尚未明了。作为一门新兴学科，网络药理学已被广泛用于研究中药治疗疾病潜在的分子机制。因此，本研究基于网络药理学初步探讨紫苏子-杏仁药对治疗哮喘的作用及机制，为紫苏子-杏仁药对治疗哮喘的研究方法提供新思路。

1 材料和方法

1.1 紫苏子-杏仁药对有效活性成分收集及靶点预测

采用TCMSP[7]数据库（TCMSP 2.3，http://tcmspw.com/tcmsp.php，中药系统药理学数据库和分析平台）检索紫苏子和杏仁的有效活性成分，以口服生物利用度（0B）＞30%、类药性（DL)＞0.18 为筛选原则筛选出符合条件的有效活性成分，然后将其靶点输入STRING[8]数据库（STRING 11.0，https://string-db.org/）中，把靶点名称(protein name)转换为基因名(gene name)。

1.2 紫苏子-杏仁药对治疗哮喘候选靶点的收集和筛选

在Genecards[9]数 据 库（Genecards 4.12，https://www.genecards.org/）的关键词搜索功能中输入Asthma，选择疾病相关Genes，与上述经STRING 转换的靶点基因名进行匹配，得到紫苏子-杏仁药对的候选作用靶点。然后在STRING 数据库的Multiple proteins 搜索功能中输入候选作用靶点名称，根据得到的蛋白相互作用网络的复杂程度调整Settings 中的“minimum required interaction score”，保证网络的可读性。最后把获得的蛋白互作网络保存为TSV格式。

1.3 网络构建及分析

从STRING 数据库中导出蛋白互作网络文件中的node1、node2 进行整合去重，得到的基因靶点及其所属有效活性成分，把有效活性成分所属的药物信息导入Cytoscape（Cytoscape 3.7.2）软件中构建“药物-有效活性成分-作用靶点”网络。然后把STRING 蛋白互作网络文件中的node1，node2 和combined score 另外导入Cytoscape 软件中得到初始蛋白相互作用网络，用工具Network Analyzer对该网络进行拓扑分析，主要根据结果中的自由度(Degree)值的大小筛选出核心靶点，最后构建核心靶点的蛋白互作网络图。

1.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析

利用DAVID[10]数据库（DAVID 6.8，https://david.ncifcrf.gov/）对紫苏子-杏仁药对作用于哮喘的预测靶点进行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，以P＜0.05为截点，获得显著富集的信号通路。

2 结果

2.1 紫苏子-杏仁药对的有效活性成分及其预测靶点信息

将紫苏子和杏仁输入TCMSP 数据库进行分析，以OB＞30%和DL＞0.18 作为条件，筛选得到紫苏子中有效活性成分16个，杏仁中有效活性成分17个，其中4 个有效活性成分无靶点。进一步筛选后得到紫苏子中有效活性成分14 个，杏仁中有效活性成分15个，共461 个靶点，重复靶点只保留1 个，去重后两者共有靶点为179 个（见表1）。把靶点输入STRING 数据库，限定研究物种为“Homo sapiens(Human)”，使靶点得以成功转换。通过与Genecards 数据库中与Asthma相关的基因进行比对，筛选得出135个候选靶点与该疾病有关。

表1 紫苏子-杏仁药对中有效活性成分及其OB和DL值

2.2 紫苏子-杏仁药对治疗支气管哮喘核心靶点的筛选

将上述得到的135 个靶点输入STRING 数据库，设定研究物种为“Homo sapiens”，得到初始蛋白质互作关系，将此数据和相关活性成分的信息导入Cytoscape软件中构建“药物-活性成分-靶点”网络，见图1。进一步设置“minimum required interaction score”为0.97，可筛选得到72个靶点及其参与的蛋白质互作关系，把72 个靶点及其关联的“combined score”另外导入Cytoscape 软件中得到初始蛋白相互作用网络，用NetworkAnalyzer 对其进行分析，构建出核心靶点的蛋白互作网络，见图2。

2.3 网络分析

图1为“紫苏子杏仁—活性成分-作用靶点”网络，其中共有167个节点，464条边，节点代表活性成分或作用靶点（绿色菱形节点代表紫苏子和杏仁活性成分，黄色菱形节点代表紫苏子和杏仁的共有活性成分，粉色椭圆节点代表作用靶点），蓝色边代表活性成分和作用靶点间的相互关系（共293 条），橙色边代表靶点之间的相互作用关系（共171条）。图2为核心靶点的蛋白相互作用网络，节点代表蛋白，边代表蛋白间的相互关系，共涉及72 个节点，171 条边。节点的大小代表Degree 值的大小，颜色深浅代表directed Edges 值的大小。节点越大代表Degree 值越大，颜色由绿变红对应的directed Edges 值越大。边的粗细代表Edge Betweenness 值的大小，边越粗Betweenness值越大。

图1 “药物-活性成分-靶点”网络

图2 紫苏子-杏仁药对核心靶点的蛋白互作网络

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析

2.4.1 GO 富集分析 将筛选后的72 个靶点蛋白导入DAVID 数据库中进行GO 富集分析，结果包括GOBP（生物过程）、GO-MF（分子功能）和GO-CC（细胞组分）分析。GO-BP 富集结果共有426 个条目，根据显著性前10的富集结果作图，见图3，包括：凋亡过程的负调控、对药物的反应、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、对雌二醇的反应、缺乏配体的外在凋亡信号通路、转录的正调控，DNA 模板、肝再生、对抗生素的反应、成纤维细胞增殖的正调控以及细胞增殖的正调控。GO-MF富集结果共有121个条目，根据显著性前10 的富集结果作图，见图4，包括：酶结合、蛋白质均二聚活性、药物结合、相同的蛋白质结合、蛋白质异二聚活性、肾上腺素结合、蛋白质结合、一氧化氮合酶调节剂活性、转录因子结合、BH3 域绑定。GO-CC 富集结果共有55 个条目，根据显著性前10 的富集结果作图，见图5，包括：核、核质、胞质溶胶、蛋白质复合物、细胞质、细胞外空间、膜筏、线粒体、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、细胞质核周区域。见表2。

表2 GO富集分析结果

图3 GO富集分析的生物过程

图4 GO富集分析的分子功能

图5 GO富集分析的细胞组分

2.4.2 KEGG 通路富集分析 用DAVID 数据库进行KEGG 通路富集分析，共得到99 条信号通路，经筛选后得到相关通路55 条，并以气泡图的形式直观表示这些通路,见图6。气泡图中节点的颜色代表P值的大小，颜色从红色到黄色反映P值从小到大；节点的大小代表相关基因的数量，节点从小到大反映相关基因的数量从少到多。其中，与哮喘显著相关的通路主要有7 条,包括PI3K-Akt 信号通路、TNF 信号通路、FoxO 信号通路、P53 信号通路、HIF-1 信号通路、T 细胞受体信号通路以及VEGF信号通路，见表3。

表3 KEGG通路富集分析中与哮喘显著相关的通路

图6 KEGG通路富集图

3 讨论

中药具有多成分、多靶点、多途径协同作用的特性，而网络药理学具有与中医相似的整体哲学，其在基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络的基础上，通过分析现有数据库的信息资料，利用专业网络分析软件和算法，系统的、整体的从网络角度去描述生物系统，药物和疾病之间的复杂性，对于探索药物-疾病之间的关联，发现药物靶标，明确药物治疗疾病的机制具有重要指导价值[11-12]。紫苏子和杏仁作为我国传统中药，均具有止咳平喘、润肠通便的功效，是治疗哮喘的常用中药。因此，本研究以两者的配伍为研究对象，运用网络药理学初步探讨其治疗支气管哮喘的作用机制，为后续实验研究提供理论依据。

“药物-活性成分-靶点”网络显示，雌酮、木犀草素、花生四烯酸、β-谷固醇、豆甾醇的靶点数较多，为紫苏子-杏仁药对治疗哮喘的关键有效活性成分。有研究表明，木犀草素能有效地降低卵清蛋白（OVA）致敏小鼠的支气管收缩和气道高反应性[13]。β-谷固醇可使OVA 致敏小鼠或豚鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞和嗜酸性粒细胞减少，减轻气道炎症，并能减轻肺组织炎症细胞浸润，减少气道重塑过程中杯状细胞增生和黏液产生[14-15]。豆甾醇能显著降低OVA 致敏豚鼠血液中嗜酸性粒细胞的数量以及血清OVA 特异性免疫球蛋白E（OVA sIgE）的水平，并能逆转炎症细胞在肺组织的浸润[16]。综上所述，紫苏子-杏仁药对可能通过减轻气道炎症，抑制气道重塑，降低气道高反应性来发挥治疗哮喘的作用。

KEGG 通路富集分析发现，主要有7 条通路与哮喘显著相关。PI3K-Akt 信号通路是本次富集结果中最显著富集的通路。有研究表明，PI3K-Akt信号通路在哮喘气道重塑中起着关键作用[17]，通过抑制PI3K/AKT信号通路可抑制气道上皮细胞的上皮-间质转化（EMT），从而抑制气道重塑[18]。PI3K/Akt还可通过调节由HIF-1a 活性介导的VEGF 表达来调节气道炎症和气道高反应性，有研究表明，可通过抑制PI3K/Akt/mTOR/HIF-1a/VEGF 通路来减轻过敏性气道炎症[19-20]。此外，TNF、p53、TCR、VEGF 等信号通路也在哮喘的发生发展中起重要作用。TNF 信号通路与气道炎症有关，TNF-TNFR2 信号的激活可通过抑制Th2 和Th17 细胞分化而减轻气道炎症[21]。气道上皮细胞中整合素β4（ITGB4）缺乏可通过激活p53 途径诱导气道上皮细胞衰老，影响哮喘的发生和发展[22-23]。TCR 信号通路与T辅助细胞分化有关，其信号传导的强度是决定Th1 和Th2 CD4+T 细胞分化的重要因素[24]。VEGF 信号通路在气道血管生成中起重要作用，气道血管生成可提示哮喘中发生的特定血管结构重塑。研究表明，信号转导和转录激活因子3（STAT3）可通过激活VEGF 信号传导来介导气道平滑肌（ASM）细胞的促进血管生成的能力[25]。

综上，本研究通过网络药理学预测，发现紫苏子-杏仁药对可通过多成分、多靶点、多通路治疗哮喘，但由于本研究主要依托数据库信息，需通过实验研究对结果进行进一步深入验证。