黄连素联合阿霉素对人前列腺癌细胞的作用

李建昌，林善鸿，曾文锋，秦性璋，林兴华，赵玉婉（广东医科大学附属医院泌尿外科，广东湛江 524001）

前列腺癌（PCa）是男性最常见的恶性肿瘤之一。化疗是转移性前列腺癌的治疗方法之一[1]。作为一线化疗药物，阿霉素（DOX）已被用于治疗急性白血病、乳腺癌、霍奇金淋巴瘤、卵巢癌等[2]，但DOX对心、脑、肝、肾具有较强的毒副作用。黄连素（BBR）作为一种天然产物，具有抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制血管生成和肿瘤转移等作用[3]，且BBR 在增强DOX 的细胞毒性时具有心脏保护作用，似可成为一种抗癌辅助药物[4]。目前研究已证实，BBR 能够提高DOX 在乳腺癌中的疗效，并降低DOX 的心脏毒性[5-6]。本研究旨在探讨黄连素联合阿霉素对PCa 细胞的影响，为PCa的治疗提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人PCa 细胞系(LNCaP、PC-3、22RV1)购买于中国科学院细胞库（中国上海），均使用RPMI-1640培养基(Waltham,MA,USA)培养，并加入10%胎牛血清(Gibco)、青霉素100 mg/L 和链霉素100 g/L（碧云天，中国上海）。

1.2 试剂和抗体

BBR 和DOX 购买于Solarbio（北京，中国），将其溶解在100%二甲基亚砜(DMSO)中作为储备溶液(BBR 300 mmol/L，DOX 1 mmol/L），-20 ℃。Bax、Bcl-2抗体购买于Cell Signaling Technology(CST)，GAPDH 选自Abcam，山羊抗兔IgG-HRP 二抗购于EarthOx（美国）。

1.3 细胞增殖检测

使用MTT 法检测人PCa 细胞的增殖。PCa 细胞系(PC-3/LNCaP：4×103细胞/孔，22RV1：1×104细胞/孔)接种在96 孔板(NEST)中，培养24 h 后，采用不同浓度的BBR(0、3、6、12、24、48 μmol/L)联合不同浓度的DOX(0、0.1、0.2、0.5、1、2 μmol/L)处理细胞48 h，以及用BBR 13 μmol/L 和DOX 1 μmol/L 分别处理细胞6、12、24、48、72 h。每孔采用0.5 g/L 的MTT 孵育细胞4 h，随后用酶标仪(EnSpire 2300 Multilabel Reader,PE)在492 nm 处检测吸光度值。评估药物对细胞生存力(%)的影响，并与Control 组细胞进行比较，Control组被指定为100%存活率。

1.4 细胞凋亡检测

Annexin V 和PI 染色检测细胞凋亡。实验分为Control、BBR、DOX 和BBR+DOX 组。BBR 浓度为13 μmol/L，DOX 为1 μmol/L，药物处理PCa 细胞24 h 后，收集细胞，PBS洗涤。使用Annexin V凋亡试剂盒(BD Pharmingen，USA)检测细胞凋亡，在室温用AV-FITC 避光染色15 min 后，洗涤细胞并用PI 孵育，流式细胞仪分析。

1.5 Caspase 3/7和Caspase 8活性测定

使用Caspase-Glo 3/7 和Caspase-Glo 8 活性检测试剂盒(Promega Corporation,Madison,WI,USA)测定Caspase 3/7 和Caspase 8 的活性。实验分为Control、BBR、DOX和BBR+DOX组。将PCa细胞接种到96 孔板(NEST Biotechnology Co.Ltd)中，加入BBR、DOX及Caspase-Glo 3/7或Caspase-Glo 8，孵育30 min后使用光度计(Berthold Sirius L,Germany)测量Caspase 3/7和Caspase 8的活性。

1.6 线粒体膜电位的测量

将PCa 细胞接种在6 孔板(1×105细胞/孔)中并孵育24 h，分别用BBR13 μmol/L 和DOX 1 μmol/L 处理。实验分为Control、BBR、DOX 和BBR+DOX 组。采用JC-1 检测试剂盒(Berthold Sirius L,Germany)在流式细胞仪（BD，美国）上检测线粒体膜电位。

1.7 三磷酸腺苷（ATP）检测

使用ATP检测试剂盒（碧云天）检测ATP的变化。实验分为Control、BBR、DOX 和BBR+DOX 组。分别用BBR13 μmol/L 和DOX 1 μmol/L 处理的细胞培养板，每孔加入200 μL 裂解液，培养皿置于冰上，使细胞充分裂解，4 °C，12 000 g，离心5 min，取上清于EP管中，加入ATP 检测工作液；常温放置3～5 min。在EP 管中加入20 μL 样品或标准品，立即用移液枪混匀，间隔3～5 s 后，用Berthold Sirius L 单管式化学发光仪检测。

1.8 蛋白质印迹分析

实验分为Control、BBR、DOX 和BBR+DOX 组。取出药物处理24 h 的细胞使用裂解缓冲液(RIPA，碧云天)裂解细胞获得细胞总蛋白，整个过程均在冰上操作。BCA蛋白质测定试剂盒（碧云天，中国）检测蛋白浓度。样品蛋白质通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，并电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF,Millipore,USA)膜上，然后用5%脱脂奶粉(1%Tween 20 和Tris 缓冲盐水)封闭，将封闭后的PVDF膜放入一抗中4 ℃孵育过夜。次日，TBST冲洗PVDF 膜3 次，每次5 min，然后在室温将其与山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶二抗(EarthOx，USA)孵育1 h。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 BBR联合DOX对PCa细胞增殖的影响

BBR 和DOX 以剂量依赖的方式抑制PCa细胞的增殖能力，与单独使用BBR 和DOX 相比，BBR+DOX能显著降低细胞的增殖能力(P＜0.05)，见图1A～C。经BBR 和DOX 处理后，细胞的融合显著减少，细胞逐渐收缩，失去正常形状，变成圆形，最终脱离培养皿。与BBR、DOX 组相比，BBR+DOX 组减少了细胞间的接触，扩散范围更小(图1D)。BBR 和DOX 以时间依赖的方式抑制细胞增殖(P＜0.05)，见图2。

图1 BBR和DOX对PCa细胞增殖的影响

图2 BBR联合DOX以时间依赖的方式抑制细胞增殖

2.2 BBR联合DOX对PCa细胞凋亡的影响

BBR+DOX 组细胞凋亡率明显高于BBR、DOX组，BBR+DOX 可显著增加PCa 细胞的早期和晚期凋亡率(P＜0.05)，见图3。

图3 BBR联合DOX对PCa细胞凋亡的影响

2.3 BBR联合DOX对PCa细胞线粒体膜电位和ATP水平的影响

BBR、DOX 和BBR+DOX 组均能够降低PCa 细胞线粒体膜电位和ATP 水平，且BBR+DOX 组降低更显著(P＜0.05)，见图4。

图4 BBR联合DOX对PCa细胞线粒体膜电位和ATP水平的影响

2.4 BBR 联合DOX 对凋亡相关蛋白表达水平的影响

与单一药物组相比，BBR+DOX 组显著增加了Bax 的表达水平，降低了抗凋亡蛋白Bcl2 的表达，显著提高了Caspase 3/7 和Caspase 8 的活性(P＜0.01)，见图5。

图5 BBR联合DOX对凋亡相关蛋白表达水平的影响

3 讨论

PCa 是男性最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年递增[7]。DOX 是PCa 化疗中常用的抗肿瘤药物之一，然而化疗的耐药性和不良反应成为PCa 治疗的主要问题[8]。据报道，BBR 作为一种潜在的化疗辅助药物，可发挥显著的抗肿瘤作用，并降低化疗药物对心脏和肝脏的毒性[6]。因此，我们评估了BBR 与DOX联合应用对PCa 细胞的影响及其潜在的作用机制。凋亡是程序性细胞死亡的过程，已被确定为癌症预防的关键[9-10]。本研究结果表明，BBR 对PCa 细胞增殖的抑制呈时间和浓度依赖性。虽然低水平的BBR 对PCa 细胞的作用有限，但它显著增加了细胞凋亡水平和细胞对DOX的敏感性。BBR增强了线粒体膜电位和ATP 水平的耗竭，这是细胞凋亡早期的标志[11]。Patil等[12]研究表明，BBR能够刺激细胞间活性氧的积累，并进一步导致人胶质母细胞瘤和乳腺癌中线粒体依赖的凋亡。Ca2+是细胞凋亡途径的参与者，线粒体中Ca2+的大量积累会增加Ca2+的释放并且促进细胞凋亡[13]。BBR 能够通过增加Ca2+的产生和释放，在多种癌症细胞中促进细胞凋亡，包括胃癌细胞、口腔癌细胞、舌鳞癌细胞、胶质母细胞瘤等[14-17]。在启动线粒体凋亡途径的过程中，决定性事件是线粒体外膜通透性的改变。当线粒体外膜通透性增加时，线粒体膜间空间蛋白（尤其是细胞色素c）被释放到细胞质中，从而激活Caspase 家族蛋白，导致数百种不同的蛋白质被裂解，从而导致细胞快速死亡[18]。此外，线粒体外膜通透性还受到BCL-2 蛋白家族成员的高度调控。该家族蛋白可分为促凋亡蛋白(Bax 和Bak)和抗凋亡Bcl2蛋白。Bax和Bak蛋白的激活能够增加线粒体外膜的通透性，而Bcl2 蛋白能够抑制Bax 和Bak 蛋白的活性[19]。本研究结果表明，BBR 提高了DOX 诱导的促凋亡蛋白Bax 的表达水平，降低了抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达，导致线粒体功能障碍，进一步导致Caspase家族蛋白的活化，包括Caspase 3/7和Caspase 8。

总之，BBR 似可通过线粒体依赖性途径抑制PCa细胞的增殖，增强DOX 的抗癌作用。这些潜在的机制仍需进一步的研究阐明，并确定BBR 联合DOX 的临床相关性。