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黄连素联合阿霉素对人前列腺癌细胞的作用

2021-11-03李建昌林善鸿曾文锋秦性璋林兴华赵玉婉广东医科大学附属医院泌尿外科广东湛江524001

广东医科大学学报 2021年5期
关键词:碧云天膜电位孵育

李建昌,林善鸿,曾文锋,秦性璋,林兴华,赵玉婉(广东医科大学附属医院泌尿外科,广东湛江 524001)

前列腺癌(PCa)是男性最常见的恶性肿瘤之一。化疗是转移性前列腺癌的治疗方法之一[1]。作为一线化疗药物,阿霉素(DOX)已被用于治疗急性白血病、乳腺癌、霍奇金淋巴瘤、卵巢癌等[2],但DOX对心、脑、肝、肾具有较强的毒副作用。黄连素(BBR)作为一种天然产物,具有抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制血管生成和肿瘤转移等作用[3],且BBR 在增强DOX 的细胞毒性时具有心脏保护作用,似可成为一种抗癌辅助药物[4]。目前研究已证实,BBR 能够提高DOX 在乳腺癌中的疗效,并降低DOX 的心脏毒性[5-6]。本研究旨在探讨黄连素联合阿霉素对PCa 细胞的影响,为PCa的治疗提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人PCa 细胞系(LNCaP、PC-3、22RV1)购买于中国科学院细胞库(中国上海),均使用RPMI-1640培养基(Waltham,MA,USA)培养,并加入10%胎牛血清(Gibco)、青霉素100 mg/L 和链霉素100 g/L(碧云天,中国上海)。

1.2 试剂和抗体

BBR 和DOX 购买于Solarbio(北京,中国),将其溶解在100%二甲基亚砜(DMSO)中作为储备溶液(BBR 300 mmol/L,DOX 1 mmol/L),-20 ℃。Bax、Bcl-2抗体购买于Cell Signaling Technology(CST),GAPDH 选自Abcam,山羊抗兔IgG-HRP 二抗购于EarthOx(美国)。

1.3 细胞增殖检测

使用MTT 法检测人PCa 细胞的增殖。PCa 细胞系(PC-3/LNCaP:4×103细胞/孔,22RV1:1×104细胞/孔)接种在96 孔板(NEST)中,培养24 h 后,采用不同浓度的BBR(0、3、6、12、24、48 μmol/L)联合不同浓度的DOX(0、0.1、0.2、0.5、1、2 μmol/L)处理细胞48 h,以及用BBR 13 μmol/L 和DOX 1 μmol/L 分别处理细胞6、12、24、48、72 h。每孔采用0.5 g/L 的MTT 孵育细胞4 h,随后用酶标仪(EnSpire 2300 Multilabel Reader,PE)在492 nm 处检测吸光度值。评估药物对细胞生存力(%)的影响,并与Control 组细胞进行比较,Control组被指定为100%存活率。

1.4 细胞凋亡检测

Annexin V 和PI 染色检测细胞凋亡。实验分为Control、BBR、DOX 和BBR+DOX 组。BBR 浓度为13 μmol/L,DOX 为1 μmol/L,药物处理PCa 细胞24 h 后,收集细胞,PBS洗涤。使用Annexin V凋亡试剂盒(BD Pharmingen,USA)检测细胞凋亡,在室温用AV-FITC 避光染色15 min 后,洗涤细胞并用PI 孵育,流式细胞仪分析。

1.5 Caspase 3/7和Caspase 8活性测定

使用Caspase-Glo 3/7 和Caspase-Glo 8 活性检测试剂盒(Promega Corporation,Madison,WI,USA)测定Caspase 3/7 和Caspase 8 的活性。实验分为Control、BBR、DOX和BBR+DOX组。将PCa细胞接种到96 孔板(NEST Biotechnology Co.Ltd)中,加入BBR、DOX及Caspase-Glo 3/7或Caspase-Glo 8,孵育30 min后使用光度计(Berthold Sirius L,Germany)测量Caspase 3/7和Caspase 8的活性。

1.6 线粒体膜电位的测量

将PCa 细胞接种在6 孔板(1×105细胞/孔)中并孵育24 h,分别用BBR13 μmol/L 和DOX 1 μmol/L 处理。实验分为Control、BBR、DOX 和BBR+DOX 组。采用JC-1 检测试剂盒(Berthold Sirius L,Germany)在流式细胞仪(BD,美国)上检测线粒体膜电位。

1.7 三磷酸腺苷(ATP)检测

使用ATP检测试剂盒(碧云天)检测ATP的变化。实验分为Control、BBR、DOX 和BBR+DOX 组。分别用BBR13 μmol/L 和DOX 1 μmol/L 处理的细胞培养板,每孔加入200 μL 裂解液,培养皿置于冰上,使细胞充分裂解,4 °C,12 000 g,离心5 min,取上清于EP管中,加入ATP 检测工作液;常温放置3~5 min。在EP 管中加入20 μL 样品或标准品,立即用移液枪混匀,间隔3~5 s 后,用Berthold Sirius L 单管式化学发光仪检测。

1.8 蛋白质印迹分析

实验分为Control、BBR、DOX 和BBR+DOX 组。取出药物处理24 h 的细胞使用裂解缓冲液(RIPA,碧云天)裂解细胞获得细胞总蛋白,整个过程均在冰上操作。BCA蛋白质测定试剂盒(碧云天,中国)检测蛋白浓度。样品蛋白质通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离,并电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF,Millipore,USA)膜上,然后用5%脱脂奶粉(1%Tween 20 和Tris 缓冲盐水)封闭,将封闭后的PVDF膜放入一抗中4 ℃孵育过夜。次日,TBST冲洗PVDF 膜3 次,每次5 min,然后在室温将其与山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶二抗(EarthOx,USA)孵育1 h。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 BBR联合DOX对PCa细胞增殖的影响

BBR 和DOX 以剂量依赖的方式抑制PCa细胞的增殖能力,与单独使用BBR 和DOX 相比,BBR+DOX能显著降低细胞的增殖能力(P<0.05),见图1A~C。经BBR 和DOX 处理后,细胞的融合显著减少,细胞逐渐收缩,失去正常形状,变成圆形,最终脱离培养皿。与BBR、DOX 组相比,BBR+DOX 组减少了细胞间的接触,扩散范围更小(图1D)。BBR 和DOX 以时间依赖的方式抑制细胞增殖(P<0.05),见图2。

图1 BBR和DOX对PCa细胞增殖的影响

图2 BBR联合DOX以时间依赖的方式抑制细胞增殖

2.2 BBR联合DOX对PCa细胞凋亡的影响

BBR+DOX 组细胞凋亡率明显高于BBR、DOX组,BBR+DOX 可显著增加PCa 细胞的早期和晚期凋亡率(P<0.05),见图3。

图3 BBR联合DOX对PCa细胞凋亡的影响

2.3 BBR联合DOX对PCa细胞线粒体膜电位和ATP水平的影响

BBR、DOX 和BBR+DOX 组均能够降低PCa 细胞线粒体膜电位和ATP 水平,且BBR+DOX 组降低更显著(P<0.05),见图4。

图4 BBR联合DOX对PCa细胞线粒体膜电位和ATP水平的影响

2.4 BBR 联合DOX 对凋亡相关蛋白表达水平的影响

与单一药物组相比,BBR+DOX 组显著增加了Bax 的表达水平,降低了抗凋亡蛋白Bcl2 的表达,显著提高了Caspase 3/7 和Caspase 8 的活性(P<0.01),见图5。

图5 BBR联合DOX对凋亡相关蛋白表达水平的影响

3 讨论

PCa 是男性最常见的恶性肿瘤之一,发病率逐年递增[7]。DOX 是PCa 化疗中常用的抗肿瘤药物之一,然而化疗的耐药性和不良反应成为PCa 治疗的主要问题[8]。据报道,BBR 作为一种潜在的化疗辅助药物,可发挥显著的抗肿瘤作用,并降低化疗药物对心脏和肝脏的毒性[6]。因此,我们评估了BBR 与DOX联合应用对PCa 细胞的影响及其潜在的作用机制。凋亡是程序性细胞死亡的过程,已被确定为癌症预防的关键[9-10]。本研究结果表明,BBR 对PCa 细胞增殖的抑制呈时间和浓度依赖性。虽然低水平的BBR 对PCa 细胞的作用有限,但它显著增加了细胞凋亡水平和细胞对DOX的敏感性。BBR增强了线粒体膜电位和ATP 水平的耗竭,这是细胞凋亡早期的标志[11]。Patil等[12]研究表明,BBR能够刺激细胞间活性氧的积累,并进一步导致人胶质母细胞瘤和乳腺癌中线粒体依赖的凋亡。Ca2+是细胞凋亡途径的参与者,线粒体中Ca2+的大量积累会增加Ca2+的释放并且促进细胞凋亡[13]。BBR 能够通过增加Ca2+的产生和释放,在多种癌症细胞中促进细胞凋亡,包括胃癌细胞、口腔癌细胞、舌鳞癌细胞、胶质母细胞瘤等[14-17]。在启动线粒体凋亡途径的过程中,决定性事件是线粒体外膜通透性的改变。当线粒体外膜通透性增加时,线粒体膜间空间蛋白(尤其是细胞色素c)被释放到细胞质中,从而激活Caspase 家族蛋白,导致数百种不同的蛋白质被裂解,从而导致细胞快速死亡[18]。此外,线粒体外膜通透性还受到BCL-2 蛋白家族成员的高度调控。该家族蛋白可分为促凋亡蛋白(Bax 和Bak)和抗凋亡Bcl2蛋白。Bax和Bak蛋白的激活能够增加线粒体外膜的通透性,而Bcl2 蛋白能够抑制Bax 和Bak 蛋白的活性[19]。本研究结果表明,BBR 提高了DOX 诱导的促凋亡蛋白Bax 的表达水平,降低了抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达,导致线粒体功能障碍,进一步导致Caspase家族蛋白的活化,包括Caspase 3/7和Caspase 8。

总之,BBR 似可通过线粒体依赖性途径抑制PCa细胞的增殖,增强DOX 的抗癌作用。这些潜在的机制仍需进一步的研究阐明,并确定BBR 联合DOX 的临床相关性。

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