黄连素联合他莫昔芬对耐药乳腺癌细胞T-47D生物学行为的影响

史梦婕，任章朋，张子京，林碧霞，林碧云 （.河南省新乡市中心医院，河南新乡4 53000；.联勤保障部队第九〇〇医院，福建福州 35000；3.广东医科大学附属医院，广东湛江 54000）

乳腺癌是全球高发的恶性肿瘤之一，发病率稳居高位，严重威胁女性的生命健康。在我国乳腺的发病率和死亡率逐年上升，且更加年轻化。60%～70%的乳腺癌属于雌激素受体阳性（ER+）和孕激素受体阳性（PR+）的激素依赖型恶性肿瘤。近十几年来以内分泌治疗药物他莫昔芬（TAM）为代表的治疗方案已经明显降低乳腺癌发病率，提高患者生存率，但在接受内分泌治疗的患者中，30%～40%患者出现耐药并复发转移。目前的研究表明乳腺癌的耐药与雌激素受体的缺失或突变、多种生长因子接到的信号转导通路异常活跃密切相关，但详细的分子机制尚未阐明。本研究以乳腺癌耐药细胞株T-47D 为研究对象，采用CCK-8、流式细胞术等实验方法分析黄连素（BBR）联合TAM 对细胞的增殖迁移能力的影响及其分子机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料与试剂

细胞培养箱（日本Espec），q-PCR 仪（roche lightcycle480），流式细胞仪。耐药性乳腺癌细胞株T-47D（购自ATCC）；抗体（cst）；CCK-8（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 分组 根据不同药物干预将乳腺癌细胞株T-47D分为4组，即阴性对照（NC）组，他莫昔芬5 μmol/L（TAM）组，黄连素50 μmol/L（BBR）组，他莫昔芬5 μmol/L+黄连素50 μmol/L联合（TAM+BBR）组。

1.2.2 细胞培养 将人乳腺癌细胞株T-47D 细胞的冻存管从液氮罐里取出，迅速放入37 ℃水浴，快速摇动促使溶液融化。待溶液完全融化后从水浴中取出冻存管，用酒精消毒冻存管表面后在净工作台打开冻存管，将含有细胞的冻存液转移至5 mL 离心管中，1 000 r/min 离心10 min(最大转速不超过1 500 r/min，以防损伤细胞)，去除含有DMSO 的上清液，用含有10%胎牛血清、100 mg/L 链霉素和100 U/mL 青霉素的完全培养基轻轻吹打混匀后用移液枪转移至T25培养瓶中。最后把接种到培养瓶中的细胞用8 mL DMEM 完全培养基稀释，轻轻吹打均匀后，37 ℃，含5%CO2温箱中培养。

1.2.3 CCK-8 实验 取对数生长期的T-47D 细胞，以每孔种5 000 个细胞种于96 孔板中放入培养箱内；待细胞贴壁后加入药物作用，每组设置5 个复孔；48 h后去除药物后，加入CCK-8 工作液（现配现用），放入培养箱孵育2～3 h；450 nm 波长测量吸光值；计算细胞的增殖能力。3 次单独重复试验的检测结果相对应的抑制率的计算公式为：抑制率=[(OD实验组－OD对照组)/OD对照组]×100%。

1.2.4 划痕实验 取对数生长期的T-47D细胞，以8×105个接种于6孔板中，待贴壁后用10 μL的tip沿标记好的方向用力均匀地划出相应的划痕，加入相应药物作用，48 h拍照保留数据进行分析。四次单独重复试验的检测结果，迁移抑制率的计算公式为：迁移抑制率=[|(面积实验组－面积对照组)|/面积对照组]×100%

1.2.5 平板单克隆形成实验 取对数生长期的T-47D 细胞，以每孔100 个细胞种于6 孔板中，加培养液至3 mL，放入培养箱；待细胞贴壁后加入药物作用，3 d换一次液；培养14～17 d 后取出6 孔板，加细胞固定液2 mL 固定细胞20 min；三蒸水冲洗，加结晶紫染色15 min；三蒸水洗干净，晾干；计数肉眼可见紫色染色点。

1.2.6 流式细胞周期实验 取对数生长期的T-47D细胞，以106个细胞接种于60 mm的培养皿，待细胞贴壁后加入药物作用，48 h 后收集细胞，用70%的酒精固定，PI染色后上机检测。

1.2.7 Western blot 实验 取对数生长期的T-47D 细胞，以106个细胞接种于60 mm 的培养皿，待细胞贴壁后加入药物作用，48 h 后收集细胞提取蛋白，加入loading buffer 变性并配平浓度，95 ℃变性5 min，5%浓缩胶，10%分离胶，用80 V 电泳30 min 后转成120 V 继续电泳60 min，然后取出以300 mA，2 h进行转膜；完成后进行5%脱脂奶粉封闭，一抗孵育2 h、TBST 洗涤，二抗孵育1 h、TBST 洗涤，进行曝光。

1.3 统计学处理

使用统计软件SPSS 22.0进行分析，3次独立实验结果以表示，多组检验用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8实验结果

与NC 组比较，TAM 组、BBR 组与TAM+BBR 组对乳腺癌细胞T-47D 细胞增殖率均明显降低(P＜0.01)，以TAM+BBR组最为显著(P＜0.01)，见图1。

图1 各组对乳腺癌T-47D细胞增殖率的影响

2.2 划痕实验结果

与NC 组比较，TAM 组、BBR 组与TAM+BBR 组对乳腺癌细胞T-47D 细胞迁移的抑制率均明显增高(P＜0.01)，以TAM+BBR组最为显著(P＜0.01)，见图2。

图2 各组对乳腺癌T-47D细胞迁移能力的影响

2.3 流式细胞术检测结果

与NC 组比较，TAM 组、BBR 组与TAM+BBR 组对乳腺癌细胞T-47D 细胞周期阻滞率均明显增高(P＜0.01)，以TAM+BBR组最为显著(P＜0.01)，见图3。

图3 各组对乳腺癌T-47D细胞周期G1的影响

2.4 western blot的实验结果

与NC组比较，TAM组、BBR组与TAM+BBR组对p-AKT/AKT、p-AMPK/AMPK 的表达量均明显增高(P＜0.05 或0.01)，以TAM+BBR 组最为显著(P＜0.01)，见图4。

图4 各组对乳腺癌T-47D细胞中p-AKT、p-AMPK蛋白表达量的变化

3 讨论

TAM 是一种选择性雌激素受体调节剂，由于TAM 效应结构的侧链和ER受体的351位氨基酸结构相似[1-3]。因此，TAM 通过竞争结合细胞核内的雌激素受体，引起构象改变，阻碍共活化剂的绑定，进而减少雌激素相关基因的转录[4-6]，抑制肿瘤细胞增殖。临床上约30%～40%乳腺癌患者在接受TAM 治疗后出现耐药、复发和转移，这是临床上治疗乳腺癌遇到的大难题，也大幅度降低了乳腺癌患者的生存周期。在TAM 耐药乳腺癌中Hh 通路的异常激活受到PI3K/AKT 通路的调节，而且在内分泌治疗耐药的乳腺癌中PI3K/AKT 过度激活[7]。PI3K/AKT/mTOR 信号通路是整合细胞外各种信号的共同通路，参与多种细胞生理活动，如细胞代谢、蛋白合成、细胞生存与增殖、血管新生及免疫功能等[8]。PI3K/AKT 通路是整合细胞外生长因子受体信号的关键调节通路，在细胞代谢、生长和存活以及糖类代谢、胞内物质运输及血管形成的调节中发挥重要作用[9]。PI3K 催化亚基的突变或者基因的扩增，下游靶点AKT 的扩增，上游受体（HER-2）的增多，PI3K/AKT通路的负调控因子PTEN基因丢失等都是这一通路在癌细胞中异常激活的关键因素，且这些因子的异常表达或激活与乳腺癌发生发展关系密切[10-12]。

植物中提取的纯天然抗肿瘤化合物是抗癌新药开发的重要手段之一。研究发现中药中许多单体成分具有抗肿瘤活性，如黄连素可以抑制多种肿瘤细胞的增殖迁移等活性。黄连素是一种常见的草本科异喹啉类生物碱，许多研究显示黄连素在抗肿瘤方面有积极作用，能诱导乳腺癌、肺癌、肠癌、肝癌细胞凋亡，抑制肿瘤增殖，还能和细胞毒性药物如长春新碱、伊立替康联用具有协同作用，且可降低肿瘤的耐药作用[13-14]。在乳腺癌中黄连素可通过调节PI3K/AKT 通路抑制肿瘤转移[15]。黄连素不仅抑制细胞生长的周期蛋白从而促进细胞凋亡，也作用于胞质中相关通路的关键蛋白并发挥抗肿瘤作用，如抑制Ras、Raf、MER-K 和PI3K 等关键蛋白活性而降低PI3K/AKT 和MAPK 通路信号传导功能。黄连素还能作用于EGFR、HER-2 等相关受体而抑制细胞的生长，而内分泌耐药的乳腺癌患者与其EGFR 被异常激活进一步激活PI3K/AKT有着潜在的关系[16]。

本课题通过研究黄连素与TAM 共同作用对TAM 耐受的乳腺癌细胞株的影响进而阐述其对细胞生物学行为的影响。本研究过程中通过CCK-8 实验结果发现，TAM 和BBR 单独作用于T-47D 细胞时其增殖率明显低于对照组，且以两种药物联合的效果更为显著，说明在药物TAM 和BBR 联合作用下可抑制细胞的增殖能力。通过划痕实验结果发现TAM 和BBR 单独作用于T-47D 细胞时其迁移抑制率高于对照组，以联合药物组更为显著，证明了两种药物的联合作用抑制细胞迁移能力强于单独作用时抑制迁移能力。通过流式细胞术的检测分析验证了两种药物单独或联合作用都会将细胞阻滞在G1 期，其中两种药物联合作用时G1期的阻滞效果相对于两种药物单独作用时的更强；通过western blot 检测了p-AKT 与p-AMPK 的表达量时，TAM+BBR 组对p-AKT/AKT、p-AMPK/AMPK的表达量均明显增高(P＜0.05 或0.01)，以TAM+BBR 组最为显著(P＜0.01)，说明两种药物联合作用时上调p-AMPK 和p-AKT 的表达效果比两种单独药物作用时更有好。

通过以上实验可以发现BBR 与TAM 具有协同作用。BBR 可以提高TAM 耐受细胞对TAM 的敏感性，进而达到抑制细胞增殖和迁移的作用，将更多的细胞阻滞在G1 期，上调p-AMPK 和p-AKT 的表达。并且BBR 作为成熟的中成药用于临床治疗，本研究可为临床TAM 耐受型乳腺癌治疗提供新的方案与理论支持。